标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。1ml的全血可得到0.5ml的血清

或血浆。每个标本量收集体积=100ul×检测种类。取材前须向销售人员索要说明书。

样品采集：收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，

将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。部分

激素类标本需添加抑肽酶。

临床及科研样品 ELISA 检测服务

操作步骤、灵敏度、测范围（RANGN）可以参照说明书

产品用途: 科研ELISA检测试剂盒.提供实验代测服务.

产品范围: 人,小鼠,大鼠,猪,兔,其它动物细胞因子;细胞凋亡,活性多肽、自身抗体 ,血栓与止血,

骨代谢,肝纤维化,肿瘤,激素内分泌、自身抗体科研ELISA检测试剂盒

试剂盒编辑

自从Engvall和Perlman（1971）次报道建立ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（Enzyme-linked ImmunosorbentAssays, ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)）以来，由于ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。尽管早期的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)试验，都大大提高了ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的特异性，加之电脑化程度高的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪的使用，使ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)更为简便实用和标准化，从而使其成为广泛应用的检测方法之一。

目前ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

试剂的性质

(一) 基本原理 ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

(二) 用于标记的酶 用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用广。

1.辣根过氧化物酶（HRP） 过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的大吸收光谱分别为275nm和403nm。

酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275

纯酶的RZ多在3.0以上，高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)中常用的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。

2.碱性磷酸酶 系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价性。酶解产物呈黄色，可溶，大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

(三) 抗体的酶标记方法及标记效果测定

1.标记方法 良好的酶结合物取决于两个条件：即价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。

2.酶标抗体标记效果测定：测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。

(1) 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。

(2) 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：

酶量（mg/ml）=OD403×0.42

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62

对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：

IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62

已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。

HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4

结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量

结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×

用于ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时。(四) ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法的基本类型、用途及操作程序

试剂盒的类型

根据ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)，即我们通常所指的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（微量板ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒),称为斑点ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)）;再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)，称为布ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（C－ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)）。在微量板ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)中，又根据其性质不同分为间接ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)、双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)、双夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)、竞争ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)、阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)及抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)。

吸附试验

1.间接ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)为例，间接ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的操作程序如下。

(1) 材料

① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；

② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；

③ ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

(2) 方法步骤

① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

2.双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)为例介绍本法的操作程序。

① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

3.双夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 此法与双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：

① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑥ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

4.竞争ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：

① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

④ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。5.阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测法为例介绍其操作程序：

① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑦ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

6.抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒) 本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)比较有代表性，该方法的主要程序为：

① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干

② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

⑤ 用ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪测定OD值。

7.斑点ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)） 与常规的微量板ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)比较，Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：(1)载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。

(2) 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。

(3) 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。

(4) 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。

(5)显色加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。

(6) 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。

8.布ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（C－ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)） C－ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)（Cloth-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)）是加拿大学者Blais, B. W.等于1989年建立的一种免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)的主要程序为：

(1) 先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；

(2) 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；

(3) 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；

(4) 加入底物液显色；

(5) 利用酶标仪测定OD值。

吸附测定

1 标本的采取和保存

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

2 试剂的准备

按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

3 加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

4 保温

在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

5 洗涤

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA?是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程如下：

（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各种化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种使用的测定方法也不断出现。

HBsAg试剂特点（检测模式：临床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗。多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与HBsAg有不同结合位点的鼠复合单位，可测得HBsAg变异样品，提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg标准品，对ad标准品的灵敏度为0.05ng/ml对ay标准品灵敏度为0.025ng/ml

ELISA检测试剂盒应用定性夹心免疫检测技术，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条，这些多肽是型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段，分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗体，这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根过氧化物酶）酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。

用途编辑

elisa技术流程

elisa技术流程

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。

特点编辑

一、、灵敏、特异的抗体；

　　二、稳定的重复性和可靠性；

　　三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相载体；

　　四、适用血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等等多种标本类型；

　　五、节省实验经费。

elisa试剂盒回收率是反应待测物在样品分析过程中的损失的程度，损失越少，回收率越高，如果作标液1PPM，就是1毫克/升，而作出标准数据为0.99毫克/升，就是说你的回收率是99%，这个与真实成分有密切的关系，说明方法的准确度。比如水中总无机氯含量测定，样品水中含有无机氯20mg/L，取100mL被测水样品，加入0.1mL浓度为10mg/mL的含无机氯标准样品，测定时忽略体积变化，如果测定出样品中无机氯为2.98mg/L，则认为回收率为99%。

制备方法编辑

包括以下步骤：

1)抗原表位的计算机筛选；

2)抗原的制备；

3)血清的采集；

4)间接ELISA方法的建立；

5)间接ELISA方法的敏感性和特异性验证；

6)试剂盒的稳定性验证；

7)对屠宰场进行临床检测。该方法简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性合格、重复性好。应用本发明制得的试剂盒能有效检出感染猪的戊型肝炎病毒，适用于大批量发病样本的检测，可用于猪戊肝的快速诊断，并预防、控制猪戊肝病毒的流行和阻断戊肝病毒由猪向人传播。

组成结构编辑

1、 血清：操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。

2、 血浆：EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、 细胞上清液：1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液。

5、 保存：如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

此IBL试剂盒能用于小鼠血清,EDTA血浆,细胞上清中白介素-6的定量检测

　　试剂盒成分

　　1 预包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 96T

　　2 酶标记抗体: (30倍浓缩)HRP标记抗小鼠白介素-6兔子IgG,亲合纯化 0.4mL x 1

　　3 标准品: 重组小鼠白介素-6 0.5mL x 2 

　　4 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 30mL x 1

　　5 标记抗体稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 12mL x 1

　　6 显色剂: TMB底物液 15mL x 1

　　7 终止液: 1N硫酸 12mL x 1

　　8 浓缩洗涤液: (40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 50mL x 1 操作说明 1实验所需器材(但试剂盒没有提供) 酶标仪(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及烧杯 去离子水 冰箱(4°C) 坐标纸(log/log) 吸水纸 试管(用于标准品稀释) 温育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)

（2）流水冲洗式 流水冲洗法初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗2分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。