1、在37℃ 5% CO2条件下将细胞加在处理的载玻片上，用培育基培育，时间通过预试验确定；

2、细胞长好后，用洗刷液洗2分钟×3次，室温下将其放入细胞固定液中固定30-60min，蒸馏水洗刷；

3、室温下用洗刷液充沛洗刷固定细胞，（干燥后-20℃冰冻保存2周以上）

4、杂交前将固定的细胞进行如下处理；顺次在70%，90%，的乙醇中浸泡，脱水每次5min，用二甲苯洗刷，除掉残留脂质顺次在，90%，70%乙醇中浸泡，进行再水化，每次5min，后浸泡于洗刷液中；

5、在37℃用胃蛋白酶溶液10min处理固定的细胞，以增加细胞对大分子试剂的通透性，再用洗刷液洗5min；

6、用1%甲醛固定10min，用洗刷液洗净。

二、留意：

1、所有溶液都必须用RNA酶抑制剂处理。

2、操作中重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。