梯度PCR在变性、延伸均可设置梯度，那么如果在摸条件时三步均设置梯度？

  1.梯度PCR仪只是方便你寻找佳PCR退火温度，可能减少你做PCR的次数和时间。使用时和楼上的兄弟说的一样，但有一点需要说明一下，就是你所设的温度梯度并不能象楼上的兄弟所说的那么简单，设温度梯度时，行的温度是需要一个简单计算的。

  举例说明：比如一个12X8的96孔板，如果一共可设12个温度梯度，也就是说每8个孔是一个温度。你所设的初始温度是56度，你设的温度梯度是14，那你每一排的温度相差就是14/12。以些类推。

   2.一个很实用且简单的方法就是你将你所设计的引物我PCR产物放到Oligo中去评价，它会给你一个佳的退火温度和循环参数，这个温度实际上就和你通过梯度PCR摸索出来的退火温度几乎是一样的。

  3.以我的经验就直接用软件给出的退火温度就没有问题。