导读：梯度PCR仪因为被扩增的不同DNA片段，其适退火温度事不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的适退火温度，进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。主要用于科研，教学机构。梯度PCR仪，在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。
梯度PCR仪使用注意事项
1、 制备测序模板：PCR仪扩增的产物可以经过低熔点的琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，用于序列分析；可经过柱层析纯化，去除PCR仪反应后剩余的dNTP和引物后，用于序列分析。PCR仪产物也可不经纯化直接用于测序，但是这种测序产生的结果较差，建议测序之前应进行PCR产物的纯化。各种标准的质粒制备方法所纯化出的质粒均可作为测序模板使用。用标准方法制备的M13噬菌体、粘粒、λDNA都适合用作测序模板用。但要注意的是反应体系中不应有与引物互补的非目的基因序列，否则将会导致测序实验的失败。
2、 测序引物：测序引物是指合成的与测序模板链特异性互补的寡核苷酸序列。可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶对引物的5‘端进行标记，反应体系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在佳的比例，以得到高比活性的标记引物；也可用α-32P-dATP标记新合成的DNA链。引物的浓度不宜高，否则容易形成引物二聚体，或产生非特异性的扩增引物。
3、 酶：各种缺乏3‘—5‘端外切活性的耐热DNA聚合酶都可以用于循环测序，其中TaqDNA聚合酶在DNA测序中为常用。虽然应用PCR循环测序法能够简单、快速的进行基因序列的测定，但仍未能适应大规模DNA序列测定的需要，而PCR循环测序法、荧光标记和自动测序仪的联合使用成为大规模基因组测序的主要技术。该技术是采用荧光标记引物或双脱氧核苷三磷酸，反应产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经特定的DNA序列分析仪和分析系统处理待测的DNA序列。它的应用减轻了DNA序列测定的工作量，提高了测序的效率。
梯度PCR仪设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。