植物总DNA的快速少量抽提(CTAB法)@古朵资讯

  实验目的：

  了解植物DNA抽提的主要方法，掌握CTAB法快速抽提水稻DNA。

  实验材料及试剂：水稻叶片，1.5×CTAB，/异戊醇(24:1)，95%乙醇或无水乙醇等

  实验原理：植物DNA的抽提常采用两种方法：

  (1)SDS法： 离子去污剂，过程长，纯度高;

  (2)CTAB法：该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作)。 CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65°C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐(>0.7mM)浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70-75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

  植物总DNA的快速少量抽提实验步骤：

  1.采集适量幼嫩叶片，用液N2研成粉末，0.4 g装入1.5ml离心管中(-20℃预冷)。

  2.预热1.5×CTAB到95℃，加1ml到装有叶片粉末的离心管中，混匀(防止冻融)。

  3.立即置于65℃水浴30min，每5分钟，上下颠倒1次。

  4.12000g离心5分钟。

  5.吸取上清液约600µl，加入等体积(600µl)/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。

  6.12000g离心5分钟。

  7.取450µl上清于一新1.5ml离心管，加入1ml 95%乙醇和45µl 10M NH4AC)，混匀，室温放置10min。

  8.12000 g离心10min，去上清，用75% EtOH浸洗沉淀，自然干燥约30 min。

  9.加入50µl 1/10 TE或无菌水(含20µg/RNase)，置于4℃过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。

  植物总DNA的快速少量抽提注意事项：

  1.尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的β-ME处理

  2.研钵预冻，粉末至加CTAB前不要融化

  3.24:1的/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头好是剪宽了的

  4.所用试剂必需灭菌，手套

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