HR8686 活性氧检测试剂盒

活性氧检测试剂盒是高品质的细胞凋亡与增殖产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，活性氧检测试剂盒是我司众多优质细胞凋亡与增殖之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括活性氧检测试剂盒(DHR荧光探针法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：活性氧检测试剂盒(DHR荧光探针法)
英文名称：ROS detection kit(DHR Probe)
产品货号：HR8686
产品规格：200T

本试剂盒是一种利用荧光探针DHR进行活性氧检测的试剂盒。可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。

DHR可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成发绿色荧光的Rho123，并稳定存在于细胞内。根据活细胞中荧光的产生，可以判断细胞ROS 含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。用488nm 激发，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

产品特点：
· 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
· 背景低，灵敏度高；
· 线性范围宽，使用方便。

试剂盒组成：

组分	规格
DHR荧光探针	1μl
探针稀释液	1ml
活性氧阳性对照诱导剂	1ml

保存条件：-20℃避光，有效期6个月

自备试剂和仪器：
· 培养基
· 移液器及吸头
· 离心机
· 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488nm，发射波长530nm。

使用注意事项：
1．螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2．荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
3．探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4．尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5．对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。
6．阳性对照诱导剂可以按照1:1000的比例使用。例如标记好探针的细胞共1ml，可以加入1μl的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。
7．DHR在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
8．对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化，很多细胞内的ROS水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。
9．DHR探针可以根据需要的用量分装后冻存，避免反复冻融。
10．DHR不可以一次性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。

使用方法：

DHR探针配制：
根据需要的用量，用探针稀释液5 倍稀释DHR探针后充分混匀，避光保存备用。稀释后的DHR荧光探针zuì好在一个月内用完，尽量避免反复冻融。

DHR探针标记：
1．DHR溶液可在新鲜无血清培养基、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，100-200倍稀释，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向无血清细胞孵育液体或灌流液中加入DHR探针溶液至所需浓度。
2．依据细胞ROS 含量的不同，DHR终浓度可选择在100-200倍稀释的范围，孵育时间可选择1-4小时，在37℃或室温进行避光孵育。
3．孵育结束后，用PBS 等新鲜溶液清洗细胞或组织。漂洗时间要短。

荧光显微镜观察：
1．对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2．荧光显微镜下观察。

流式细胞仪分析：
1．对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5～1ml 冰冷PBS 重悬细胞（5～10万）。
2．采用488nm 波长激发，测定待测细胞平均荧光强度。

根据您的关注的活性氧检测试剂盒(DHR荧光探针法)，您可能还对以下产品有需求：



名称：XTT细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒
货号：BTN140635
规格：500次
XTT能被活细胞里的线粒体脱氢酶降解而产生橙黄色水溶性的甲臜，通过测定甲臜的光谱吸收，进而可以测定细胞的增殖情况。XTT与MTT同属四唑氮衍生物，它们检测细胞活性的反应原理相似，原理图如下：


产品特点：
1．盒灵敏度，可检测低细胞密度样品，检测结果的重复性优于MTT。
2．操作简便、快捷。可直接加入到检测平板。在96-孔板中检测时，无需洗涤或收获细胞，免去溶解步骤。
3．无放射性。不需要配制液闪混合物，也不需要处理废弃物。
4．与MTT相比，使用更安全。不需要使用挥发性的有机溶剂来溶解甲基产物。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	5ml
溶液B	50ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存(但溶液B也可以常温运输和保存)，有效期一年。

使用方法：
下面操作是检测细胞毒性的试验，其他应用跟此类似或更简单(如生长曲线试验)，操作步骤可以以此为基础稍作修改即可，故不再赘述。

㈠、接种细胞
1．按常规胰酶消化法消化汇合的单层细胞，收集到含血清的培养基中。
2．200g离心5分钟收集细胞沉淀。
3．用培养基重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬浮液并计数。
4．将细胞稀释到2.5×103个/mL～5×10个/mL之间(需要根据细胞的生长速度决定)，如果不知道生长数度，一般可以稀释到1×10个/mL。
5．将足够量的细胞悬液转移到培养皿中(便于用排枪取样)。一个96孔板的MTT检测需要约20mL的细胞悬液。
6．用排枪在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL细胞悬液(对正常细胞)。如果是肿瘤细胞，则加入100μL肿瘤细胞悬液和100μL培养基(总体积为200μL)。
 注意：一定要把细胞加在孔的正中，否则细胞会聚集在孔的角落处，影响试验。
7．用排枪在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟细胞悬液等体积的培养基。第1 列各孔将作为+培养基-细胞+MTT对照(用于测OD时调零)，第12列加培养基的作用是减少边缘效应对第11列反应的影响。
8．按常规细胞培养方法在37℃和5% CO2条件下孵育1-3天，使细胞进入指数生长期。

㈡、药物处理
9．用培养基将药物稀释到8个待测浓度(如果不知道待测浓度，则需要预试验确定)，一般一种药物需要做3块平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培养基(不要触动细胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培养基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鲜培养基，这些孔将作为+培养基+细胞-药物的对照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8个浓度梯度的待测药物，每列加入一个浓度的药物。
13．按常规方法把96孔板继续放在37℃和5% CO2条件下孵育一定的时间，此段时间即为药物处理细胞的时间，由用户自己决定。
14．处理结束后去除第2到第11列(共10列，均含细胞)所有孔中的培养基，并再加入100μL新鲜培养基。
15．每天换培养使细胞数量扩增2-3倍(所需时间随细胞不同而不同)。

㈢、存活细胞计数
16．在生长末期，去除第1到第11列各孔中的培养基后，再加入100μL新鲜培养基和10μL溶液A(含MTT成分)，用锡箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2条件下继续培养4-8小时。
 注意：溶液A在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴至全部溶解，摇匀后使用。MTT有致癌性，一定要带手套操作。
17．小心吸弃孔内培养基(含溶液A)。由于培养基可能会影响光吸收，zuì好尽可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置摇床上低速振荡10分钟，使MTT形成的formazan结晶物充分溶解。
19．由于产物不稳定，故需要立即在酶联免疫检测仪上选择490nm测定吸光度。
 注意：用第1 列各孔(+培养基-细胞+MTT对照)调零。
20．计数同样处理的各次重复的平均值。
21．以药物浓度为横轴，以吸光度为纵轴绘制曲线。由于各处理吸光度值差别很大，一般需将其转化成生长抑制率(以不加药物的第2和第11列各孔数据的平均数作为)，这样便于计算出IC50，用于各种药物处理效果的比较。
 注意：如果测生长曲线，则以时间为横轴。正常生长曲线一般呈现S型，具有促进作用的则斜率加大。

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