QN2866 Caspase-3活性测定试剂盒

Caspase-3活性测定试剂盒是高品质的细胞凋亡与增殖产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科学研究，Caspase-3活性测定试剂盒是我司众多优质细胞凋亡与增殖之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括Caspase-3活性测定试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Caspase-3活性测定试剂盒
英文名称：Caspase-3 Activity colorimetric assay Kit
产品货号：QN2866
产品规格：20T|50T|100T

本试剂盒适用于测定哺乳动物组织、细胞caspase-3活性。测定原理基于Caspase-3特异水解多肽底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)，释放硝基苯胺pNA。游离硝基苯胺pNA呈黄色在405nm具有zuì大吸收峰，用普通可见光分光光度比色方法测定。根据pNA标准管吸光度OD值和标准曲线，计算来自底物肽释放的pNA浓度，得到Caspase-3水解活性。

Caspase-3是凋亡过程中zuì主要的终末剪切酶，因而也是研究zuì多的caspase，它激活pro-caspase-2,6,7,9等，特异水解多种凋亡关键蛋白如PARP，介导细胞核染色质固缩、凋亡小体生成、核DNA断裂。

试剂盒组成：

组分	规格(100T)	保存条件
裂解缓冲液	20ml	4℃
反应缓冲液	10ml	4℃
2mM Ac-DEVD-pNA底物	0.5ml	-20℃避光
10mM pNA标准品	0.5ml	-20℃避光

运输及保存：试剂常温运输。到达后按要求储存，1年内稳定。
所需仪器：酶标仪与96孔酶标板；或可见光分光光度计配100μl容积的石英比色杯。
工作波长：zuì大吸收波长405nm，如不具备也可在400～450nm范围内测定，但灵敏度略降。

操作步骤：

一、组织细胞准备：
Caspase活性测定值低，zuì常见原因是未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间点不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。可设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测zuì佳的观察点。通常2×10⁷细胞或2mg组织裂解于1ml可产生1～3mg/ml蛋白。初次测定时，单个测定反应可加~200μg蛋白物对应于2×10⁶细胞或2个孔的6孔板细胞。zuì少，单个测定反应需加20μg蛋白对应于2×10⁵个细胞或2个孔的12孔板细胞。勿用丝氨酸蛋白酶抑制剂如E-64和leupeptin以免抑制Caspase活性。
1．裂解样本：
细胞裂解：1000g 5分钟收集细胞，吸尽上清。每2～10×106细胞加50～100µl裂解液震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。
组织裂解：3～10mg组织加100 µl裂解液放入小型玻璃匀浆器，上下匀浆30次。转移匀浆液于离心管。
2．在4℃条件下12,000g离心10分钟，取上清测定，或-70℃保存。
3．蛋白定量：用Bradford法测定蛋白浓度。裂解液含还原剂不宜采用BCA法。应使蛋白浓度达到1～3mg/ml，相当于每10μl待测样品含10～30μg蛋白，否则应增加细胞用量。

二、测定pNA标准曲线：
1．用反应缓冲液稀释10mM pNA标准品为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μM。设置不加pNA的零管。
2．每一浓度取100μl加入96孔板或100μl比色杯，测定405nm 吸光度OD值。
3．每一浓度标准管OD405值为x轴，对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对OD405值的标准曲线。

三、样品测定操作：
1．按下表设置96孔板反应体系。底物zuì后加入以使各管反应起始时间相同。设置不加样品的空白对照管。酶活力不足或过高，可增加或减少样品。
2．盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃反应2小时，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
3．样品管OD405减去空白对照OD405，为样品Caspase水解底物产生的pNA吸光度。根据标准曲线计算其含量，并以蛋白浓度校正之。
4．测得的Caspase酶活性表示方法有两种。
  a、Caspase活性增加的百分比：×实验处理组OD/实验对照组OD，简单而可靠。
  b、样品Caspase酶活力单位/mg protein，但计算较复杂，参见说明。
  反应体系参考表 (允许适当调整样品加样量)
  

	无样品空白对照	高酶活性样品	低酶活性样品
反应缓冲液(μl)	95	85	60
待测样品(μl)	-	10	35
底物(μl)	5	5	5
总体积(μl)	100	100	100

相关说明：
1．Caspase酶活力单位定义：当底物饱和时,一个Caspase酶活力单位定义为37℃，1小时水解pNA底物，产生1nmol游离pNA。根据pNA标准曲线和样品OD值，可计算出Caspase酶活力单位。
2．除了处理组外，可设置阳性凋亡诱导剂组，阴性实验对照可包括不具有凋亡诱导作用的试剂(如果能得到)处理组、溶剂对照组、或凋亡诱导零时间点。

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名称：细胞凋亡与坏死检测试剂盒
货号：YT130
规格：100次
本试剂盒提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡与细胞坏死检测方法。染色快速方便，两种染料的染色仅需20-30分钟，一步染色即可完成。使用方便，使用流式细胞仪检测时，无需稀释等配制过程，也无需再准备其它任何溶液。本试剂盒足够检测100个样品，每个样品的细胞数量可以为10-100万。

试剂盒组份：
细胞染色缓冲液———100ml
Hoechst染色液———0.5ml
PI染色液——————0.5ml

本试剂盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。
Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。上述两种染料双染后，使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时，正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光，坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光。参考下图，左图为诱导凋亡前的正常细胞，右图为诱导凋亡后的细胞。



注意事项：
1. 需使用流式细胞仪进行红色和蓝色双荧光检测。也可使用荧光显微镜检测。
2. 染色后宜尽快检测。
3. Hoechst 33342对人体有害，碘化丙啶(PI)对人体有刺激性，请注意适当防护。

储存条件：-20℃避光，有效期一年。

名称：罗丹明123
货号：YT149
规格：5mg
本品是一种可以通透细胞膜的选择性染色活细胞线粒体的荧光染料，广泛用作检测线粒体膜电位的荧光探针，也常用于细胞凋亡检测。

Rhodamine 123可以快速通过细胞膜，仅需几分钟就可以被具有活性的线粒体所俘获，并且对细胞没有任何毒性。Rhodamine 123的zuì大激发波长为507nm，zuì大发射波长为529nm。在荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光。Rhodamine 123为红棕色粉末，溶于DMSO，也溶于乙醇，在乙醇中的溶解度可达20mg/ml。

CAS：62669-70-9
分子式：C21H17ClN2O3
分子量：380.82
纯度：＞95%

储存条件：室温，有效期2年。

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