WH0059 微量样本总RNA提取试剂盒

微量样本总RNA提取试剂盒的品牌是百奥莱博，是优质的RNA提取纯化产品，本制品仅用于生物化学研究方面，本品质量稳定，价位合理，需要微量样本总RNA提取试剂盒等RNA提取纯化产品的客户，欢迎您的随时垂询。...

特别提示：包括微量样本总RNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：微量样本总RNA提取试剂盒
英文名称：Total RNA Extraction Kit from trace sample
产品货号：WH0059
产品规格：50次

本试剂盒采用、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从多种不同类型的微量样品中快速提取总RNA。本试剂盒特别加入了Carrier RNA，可以从体系中轻松捕获微量核酸,具有方便快捷、产量高、重复性好的特点，30-40分钟内即可完成反应。与其它提取RNA的普通方法相比，微量样品RNA提取试剂盒将所有<200bp的RNA（5.8S rRNA,5S rRNA和tRNAs等）选择性的筛除，而所有>200bp的RNA则被富集、分离和纯化。提取的总RNA纯度高，没有DNA和蛋白质污染。

产品特点：
·从微量的样本中纯化得到的高质量的RNA，如显微切割得到的组织，纤维组织和细胞。
·配有的DNase Ⅰ，可有效去除DNA污染。
· RNA纯度更高，无杂质残留，特别适合于对纯度要求很高的下游实验。
·操作安全可靠，无需酚/氯fǎng抽提，无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀。

下游应用：
· RT-PCR。
· Northern Blot、Dot Blot。
· Real-Time PCR。
·芯片分析。
· polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

Carrier RNA的作用：
试剂盒中提供了一种特殊Carrier RNA，当需要从非常少量的样品中提取RNA时，推荐在操作步骤中加入Carrier RNA，这样有助于提高RNA与吸附柱的结合。

试剂盒组成：

组分	50T
裂解液RL	30ml
去蛋白液RW1	40ml
漂洗液RW	12ml
Carrier RNA	310μg
DNase I	1500U
缓冲液RDD	4ml
RNase-Free ddH2O（管装)	1ml
RNase-Free ddH2O（瓶装)	2×15ml
RNase-Free吸附柱CR1（含2ml收集管)	50套
RNase-Free离心管（1.5ml)	50个

储存条件：在室温（15-25℃)条件下运输，收到试剂盒后，请立即将RNase-free DNase I,缓冲液RDD和RNase-free ddH2O置于2-8℃保存，其他试剂可置于室温（15-25℃)保存。

选配试剂：蛋白酶K（目录号：WH0215）；研磨杵（目录号：WH9004）；过滤柱CS：（目录号：RK124）

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇

使用前注意事项：
1．为了防止RNA的降解，请避免未处理的样品在室温长时间放置，在组织固定前，RNA处于无保护状态，所以请将组织在液氮中速冻。
2．组织裂解液（在裂解液RL中）可在-70℃储存数月。处理冻存的裂解液时，可在室温或37℃水浴中将样品完全解冻，而且请注意裂解液中的盐需要完全溶解，之后立即进行后续操作。（长时间37℃处理将会导致RNA的化学降解）。
3．所有步骤在室温进行，为了尽量避免RNA的降解，操作越快越好。
4．在使用前，请用RNase-Free ddH2O配制乙醇溶液。
5．操作前在RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1ml RL中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液zuì好现用现配。配好的RL可在4℃放置一个月，裂解液RL在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
6．次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

表1：微量样品RNA提取试剂盒技术指标

zuì大吸附能力	45μg RNA
吸附柱zuì大容量	700 μl
提取RNA的长度	>200 bp
zuì小洗脱体积	10μl
样品使用zuì大量（动物细胞）	5×105
样品使用zuì大量（动物组织）	5mg

  注意：如果超出该试剂盒的zuì大吸附能力，RNA的产量可能会降低，而如果样品未能裂解完全，RNA的产量也会降低。

表2：不同培养条件下HeLa细胞的数量

细胞培养器皿	生长面积（cm2）	细胞数量
96孔细胞培养板	0.32-0.6	4-5×104
48孔细胞培养板	1	1×105
24孔细胞培养板	2	2.5×105
12孔细胞培养板	4	5×105
6孔细胞培养板	9.5	1×106
平皿（35mm）	8	1×106
摇瓶（40-50ml）	25	3×106

3．样品的储存和处理
组织若不经过处理，其中的RNA处于无保护状态，容易被降解，所以新鲜组织应及时放入液氮中速冻并立即储存于-70℃，冻存的组织不能反复冻融以避免RNA的降解，样品也可以在匀浆后加入裂解液RL，储存于-70℃，冻存的样品可稳定储存数月。
4．样品的裂解和匀质
有效的裂解和匀质是提取RNA的重要步骤，裂解和匀质是两个不同的步骤。
裂解：将组织和细胞完全裂解，以彻底释放出样品中所有的RNA，不同的样品裂解的方法不同，如果样品裂解不彻底，将导致RNA得率低。
匀质：匀质的过程是为了降低细胞裂解后的溶液粘度，将高分子量的基因组DNA和其他物质切断，形成均一的溶液，利于RNA与硅基质膜的结合。如果匀质过程未处理好，将影响RNA与硅基质膜的结合，从而导致RNA提取量低。匀质的方法包括匀浆、涡旋振荡、过滤柱、注射器或枪头吸取等。
5．Carrier RNA：
当处理<10 μg组织或<5000个细胞时，可将试剂盒中提供的Carrier RNA加入裂解液中，实验证明，Carrier RNA的加入将提高RNA的得率，且不会影响后续实验。

相关溶液的配制：

DNase I储存液的配制：请小心打开装有DNase I的玻璃管盖子，以避免造成DNase I的损失，将DNase I干粉（1500U）溶解在550μl RNase-Free水中，轻柔地上下颠倒混匀DNase I溶液，不要涡旋振荡。
如需长时间保存DNase I溶液，请将玻璃瓶中的DNase I溶液进行分装，在-20℃可保存9个月，DNase I溶液融化后可在2-8℃保存6周，溶解后的DNase I溶液不能再次冷冻。

Carrier RNA储存液的配制：在次使用Carrier RNA时，将Carrier RNA（310 μg）溶解在1ml RNase-Free ddH2O中，将溶液分装后储存于-20℃，此时该溶液的浓度为310 μg/ml（310ng/μl）；该储存液应避免反复冻融，冻融次数不能超过3次。（当处理的细胞量小于5000个时，请在裂解液中加入Carrier RNA。）

Carrier RNA工作溶液的配制（以配制10次用量为例）：将5 μl Carrier RNA储存溶液加入34 μl裂解液RL中，用移液器混匀，将混匀后的溶液6 μl加入54 μl裂解液RL中，此时Carrier RNA终浓度为4 ng/μl，取5 μl终浓度为4 ng/μl的Carrier RNA加入裂解液中。

操作步骤：

一、从微切割的冷冻样品中提取总RNA
以下的操作步骤适用于从冷冻的微切割动物组织中分离RNA。要从非常微量的样品中提取RNA是一项很有挑战性的工作，同时要注意，固定和处理样品的过程可能会对RNA完整性造成影响。

1．向样品中加入适量的裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%) （加入裂解液RL的体积与微切割仪器容积有关，但不能超过zuì大体积为（A) 65 μl （B) 300 μl。)
  注意：（A)指的是微切割仪器Leica AS LMD系统可采用的体积，（B)指的是其他微切割系统可使用的裂解液体积，以下出现的（A) （B)与此一致。
2．如果需要，可将样品和裂解液RL转移至一个较大的1.5 ml或2 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）。补充裂解液RL至体积为（A)75 μl （B)350 μl。
  注意：（A) （B)所指的意义同步骤1，当处理的细胞量小于5000个时，向溶液中加入20 ngCarrier RNA（5 μl 4 ng/μl Carrier RNA），Carrier RNA溶液的配制请见第4页溶液配制说明。
3．涡旋振荡30 sec，使样品匀质化。
4．向样品中加入1倍体积（（A)75 μl （B)350 μl）70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
  注意：如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
5．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在RNase-Free的2 ml收集管中，该收集管试剂盒中已经备有)，轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
11．重复步骤10。
12．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
13．将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管（试剂盒中已备用）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm （~13400×g)离心1min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。


二、从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA
以下操作步骤适用于从福尔马林固定的微切割样品中提取总RNA。在从福尔马林固定的微切割样品中提取RNA时，主要的影响因素有：样品的新旧程度、固定的过程和样品的储存条件。RNA可能会降解成<300bp的片段，而本试剂盒能有效吸附>200bp的片段，所以如果样品中的RNA高度降解，可能会出现提不出RNA的情况。

1．预先加热水浴至55℃，为第5步中的蛋白酶K（客户自备，目录号：WH0215）消化做准备。
2．向样品中加入适当体积的裂解液RL（使用前请向RL中加入β-巯基乙醇，终浓度1％），加入裂解液RL体积与微切割仪器的容积有关，但不能超过140 μl。
3．如果需要，可以将样品和裂解液RL转移至1.5 ml或2 ml的RNase-Free的离心管中（客户自备）。补充裂解液RL至体积为150 μl。
  注意：当处理的细胞量小于5000时，向溶液中加入20 ng Carrier RNA （5 μl 4 ng/μl Carrier RNA工作液），Carrier RNA工作溶液的配制请见第4页溶液配制说明。
4．向溶液中加入295 μl RNase-Free ddH2O，然后加入5 μl蛋白酶K溶液（浓度20 mg/ml，客户自备)，用移液器混匀，55℃孵育10 min。室温12000rpm （~13400×g)离心3min。
  注意：此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。
5．用移液器将上层溶液（450 μl左右）转移至一个新的RNase-Free离心管中（客户自备）。
  注意：使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。
6．向吸出的上层溶液中加入0.5倍体积的无水乙醇（通常为225 μl），用移液器混匀。
  注意：在加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
7．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，此收集管试剂盒已经备有），轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
9．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。
10．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
11．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
12．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
13．重复步骤12。
14．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
15．将吸附柱CR1放入一个新的1.5 ml RNase-Free离心管中（试剂盒中已备有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm（~13400×g )离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

三、从动物组织中提取总RNA
以下操作适用于从大多数动物组织中提取RNA，如果要从纤维组织中提取RNA，请参考后面的相关方法。从动物组织中提取RNA，若要得到高纯度和高产量的RNA，组织的起始量非常重要，本试剂盒提供的吸附柱CR1zuì大结合能力为45μg，裂解液zuì多能裂解5mg的组织。有些组织像脾脏、部分脑组织、肺组织和胸腺组织在提取的过程中有可能会形成一些沉淀，但不会影响RNA的提取。推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

1．确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第2步。
2．在裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％)中将组织块切碎和匀浆（请见步骤2a，2b）
  注意：组织块的切碎和匀浆过程可采用下列2a和2b两种方法之一，当处理小于10 μg的组织时，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作溶液（5 μl 4 ng/μl)，Carrier RNA工作溶液的配制请见第4页溶液的配制说明。匀浆不彻底将导致RNA提取量低，还可能导致堵塞吸附柱CR11的现象发生。
2a 使用匀浆器进行匀浆：将称重过的组织块放在一个大小合适的容器中，加入350 μl裂解液RL，立即进行匀浆至均一溶液（通常时间为20-40 sec），继续步骤3。
2b 使用研磨杵（客户自备，目录号：WH9004）进行研磨：在1.5 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）加入350 μl裂解液RL，将组织块迅速从-80℃转入这个离心管中，用研磨杵充分研磨，彻底将组织破碎，注意避免组织冻融。将此溶液移至过滤柱CS（客户自备，定购信息见第1页）上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g )离心2 min，收集滤液，继续步骤3。
3．将匀浆好的样品（2a）或者过滤液（2b）以12000rpm （~13400×g )离心3 min，用移液器仔细将上清液转移到新的1.5 ml RNase-Free离心管中（客户自备）。
4．向上清中加入1倍体积（350 μl)70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第5步。
  注意：如果在以上过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。在乙醇加入后，溶液中可能会出现沉淀，但不会影响RNA的提取。
5．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，试剂盒中已备有），轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
7．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
8．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
9．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
10．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
11．重复步骤10。
12．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
13．将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管中（试剂盒中已备有），向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm （~13400×g)离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

四、从纤维组织中提取总RNA
纤维组织，例如骨骼肌、心脏、皮肤中含有大量的收缩蛋白、连接组织和胶原质，只有去除这些蛋白质，才能使RNA的提取顺利进行。所以在从纤维组织中提取总RNA时，引入了蛋白酶K消化这一过程。
采用以下操作，可成功地从心脏、肌肉和皮肤组织中提取RNA，其他富含蛋白质的组织也可采用此方法进行RNA的提取，值得注意的是，在进行蛋白酶K消化过程中的缓冲液不能对RNase进行长期有效的抑制，因而此方法不适用于含有丰富RNase的脾脏和肠组织等RNA的提取。
推荐使用的组织量不超过5mg，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

1．预先加热水浴至55℃，为第5步中的蛋白酶K（客户自备，目录号：WH0215）消化做准备。
2．确定组织的总量，不要超过5mg，立即进行第3步。
3．在裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1％）中将组织块匀浆（3a）或者研碎（3b）。
  注意：当处理小于10 μg的组织时，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA工作液（5 μl 4 ng/μl溶液)，Carrier RNA溶液的配制请见第4页溶液的配制说明。匀浆不彻底会导致RNA提取量低，还可能导致吸附柱CR1堵塞。采用匀浆器或过滤柱进行匀浆，会比采用其他方式匀浆获得更高的RNA得率。
3a 使用匀浆器进行匀浆：将称重过的组织块放在一个大小合适的容器中，加入150 μl裂解液RL，立即进行匀浆至均一溶液（通常时间为20-40 sec），继续步骤4。
3b 使用用研磨杵（客户自备，目录号：WH9004）进行研磨：在1.5 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）加入150 μl裂解液RL，将组织块迅速从-80℃转入这个离心管中，用研磨杵充分研磨，彻底将组织研碎，注意避免组织冻融，继续步骤4。
  注意：当使用研磨杵研磨时，请务必将组织彻底研碎，以保证裂解充分
4．向溶液中加入295 μl RNase-Free ddH2O，然后加入5 μl蛋白酶K溶液（浓度为20 mg/ml，客户自备，目录号：WH0215），用移液器混匀。55℃孵育10 min。室温12000rpm（~13400×g )离心3 min。
  注意：此时的组织碎片可能会形成小球，有时在溶液上面会浮有一层薄膜。
5．用移液器将上层溶液（通常450 μl左右）转移至一个新的1.5 ml RNase-Free的离心管中（客户自备）。
  注意：使用移液器吸取上层溶液时，一定要避免接触到组织碎片小球，而且枪头要伸到薄膜以下进行吸取，避免将薄膜转移至离心管中。
6．向吸出的上层溶液加入0.5倍体积的无水乙醇（通常为225 μl），用移液器混匀。
  注意：在乙醇加入后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
7．将所有溶液及沉淀物质全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml收集管中，试剂盒已经备有），轻柔地盖上管子，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，倒掉废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
9．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
10．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
11．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
12．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
13．重复步骤12。
14．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
15．附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管（试剂盒中已备用）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm （~13400×g )离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。


五、从动物细胞中提取总RNA
从动物细胞中提取RNA，若要得到高纯度和zuì佳产量的RNA，细胞的起始量非常重要，本试剂盒提供的吸附柱CR1zuì大结合能力为45μg，而裂解液zuì多能裂解5×10⁵的细胞。推荐使用的细胞量不超过5×10⁵，请不要超过吸附柱CR1的载量，否则将会降低RNA的产量和纯度。

1．细胞的处理和裂解
1a 细胞沉淀：轻弹管底使细胞分开，加入350 μl裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%），涡旋振荡或用移液器混匀，继续步骤2。
1b 悬浮培养细胞：确定细胞的数量（见表2），在RNase-Free的离心管（客户自备）中300×g离心5 min沉淀细胞，去除所有上清，加入350 μl裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%），继续步骤2。
1c 单层贴壁细胞：对于该种细胞的收集可直接在细胞培养器皿中进行（直径zuì大为10cm），或者可以先用胰蛋白酶消化，再收集细胞沉淀，进行裂解。
  直接在细胞培养器皿中进行裂解：确定细胞数量，将细胞培养基完全吸出，加入350 μl裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度为1%）裂解细胞，收集细胞裂解液并将其转移至1.5 ml RNase-Free离心管（客户自备）中，涡旋振荡或用移液器混匀，确保看不见任何成团的细胞之后，继续步骤2。
  胰蛋白酶消化（摇瓶中培养的单层贴壁细胞，通常采用胰蛋白酶消化的方法)：确定细胞数量，吸出培养基，用PBS缓冲液洗细胞，吸除PBS缓冲液，加入含有0.10-0.25%胰蛋白酶的PBS缓冲液处理细胞，在细胞脱离容器壁后，加入含有血清的溶液使胰蛋白酶失活，将细胞转移到RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min沉淀细胞，仔细去除所有上清。加入350 μl裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇，终浓度1%）裂解细胞。继续步骤2
  注意1：如果细胞培养基没有去除干净，将会稀释裂解液，影响裂解效果及RNA与硅胶树脂膜的结合，这将导致RNA的提取量降低。
  注意2：当处理的细胞量≤1×10⁵时，裂解液RL的加量可以减少至75 μl，这时可采用小一些的离心管，涡旋振荡1 min使裂解液匀质化，进行步骤3。
  注意3：如果处理细胞量<5000时，需要向裂解液中加入20 ng Carrier RNA （5 μl 4 ng/μl溶液)，Carrier RNA溶液的配制请见第四页溶液配制说明。
  注意4：如果细胞重悬不完全，将会导致裂解不充分，降低RNA的产率。
2．样品的匀质化（请见步骤2a，2b）
  注意：匀质不彻底将导致RNA提取量低，还可能导致吸附柱CR1堵塞，采用匀浆器或过滤柱进行匀质，会比采用其他方式匀浆获得更高的RNA得率。
2a 将加入裂解液的细胞转移至过滤柱CS（客户自备，订购信息见第1页）上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g )离心2 min，收集滤液，继续步骤3。
2b 使用匀浆器匀浆30 sec。
3．加入1倍体积（通常为350 μl）70%乙醇，用移液器混匀，立即进行第4步。
  注意：如果在匀质的过程中损失了一些裂解液，70%乙醇的加量也要相应减小。如果在第2步中只加入了75 μl的裂解液RL，则在本步骤中也只需加入75 μl的70%乙醇，加入乙醇后，溶液中可能会出现沉淀，但是不会影响RNA的提取。
4．将所有溶液及沉淀全部转移至吸附柱CR1上（吸附柱CR1放在2 ml RNase-Free的收集管中，此收集管试剂盒中已经备有），轻柔地盖上管盖，12000rpm （~13400×g )离心30-60 sec，弃废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
5．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
6．DNase I工作液的配制：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70 μl RDD溶液，轻柔混匀。
7．向吸附柱CR1中央加入80 μl的DNase I工作液，室温放置15min。
8．向吸附柱CR1中加入350 μl去蛋白液RW1，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
9．向吸附柱CR1中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 min，12000rpm（~13400×g)离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR1放回收集管中。
10．重复步骤9。
11．12000rpm（~13400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CR1置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR1在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。
12．将吸附柱CR1放入一个新的RNase-Free离心管（本试剂盒中已经备有）中，向膜中央加入14 μl RNase-Free ddH2O，轻柔地盖上管盖，室温放置2 min。12000rpm（~13400×g )离心1 min，所得溶液即为RNA溶液。
  注意：洗脱体积不得少于10μl，可用减小洗脱体积的方法得到较高浓度的RNA，但是这将影响总的RNA得率。

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试剂盒组成：

组份	50次
DNase I	1000 U
10×Reaction Buffer	1000μl
Buffer RL	35ml
Buffer RLC	35ml
Buffer RW1	40ml
Buffer RW2(浓缩液)	11ml
RNase-Free Water	10ml
过滤柱FL及收集管	50套
吸附柱RM及收集管	50套
RNase-Free离心管(1.5ml)	50个

保存条件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它组分室温(15～30℃)。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇(新开封或提取RNA专用)。

实验前准备及重要注意事项：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
① 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
② 配制溶液应使用无RNase的水。
③ 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、预防RNase污染，应注意以下几方面：
① 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
② 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
③ 配制溶液应使用无RNase的水。
④ 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
3、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
4、Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。Buffer RLC使用时不需加β-巯基乙醇。
5、次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
6、Buffer RL和Buffer RLC如果产生沉淀，请加热使其溶解后室温放置。
7、所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤：
1、50-100 mg植物组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前检查是否加入β-巯基乙醇)或Buffer RLC。涡旋振荡使其充分裂解。
注意：
① Buffer RL主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解。但有些植物组织(如玉米的胚乳)，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳，此时可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
② 56℃孵育1-3分钟有助于组织的裂解，但是淀粉含量高的植物不要进行高温孵育。
2、将步骤1所得全部液体转移至已装入收集管的过滤柱中，12000rpm(~～13400×g)离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管(自备)中。
注意：
① 在吸取液体时可以将枪头剪掉，便于取样。
② 过滤柱FL可以除去大部分的碎片，但仍会有小部分流出，离心后会在收集管内形成沉淀，在进行下一步时注意避免吸到沉淀。
3、在步骤2所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。
注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。
4、将上步得到的溶液转移到已装入收集管的吸附柱中,若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入; 12000rpm离心15秒，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、配制DNase I 混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混匀， 配制成终体积为80μl的反应液。
7、向吸附柱中直接加入80μl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。
8、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1, 12000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前检查是否加入无水乙醇), 12000rpm离心15秒,弃废液。
10、重复步骤9。
11、将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心1分钟，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
12、将吸附柱装入新的离心管中，向吸附膜的中间加入30-50μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。
注意：
① RNase-Free Water体积不应小于30μl，体积过小影响回收率。
② 如果要提高RNA的产量，可用30-50μl新的RNase-Free Water重复步骤12。
③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。

储存条件：室温(15～30℃)。

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