WH0112 HRM分析试剂盒（染料法)

北京百奥莱博供应的HRM分析试剂盒（染料法)用于科学研究，我公司的HRM分析试剂盒（染料法)品质上佳，经过多年的开发生产，已然非常成熟，欢迎广大新老客户订购。...

特别提示：包括HRM分析试剂盒（染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：HRM分析试剂盒（染料法)
英文名称：HRM Analysis Kit （EvaGreen)
产品货号：WH0112
产品规格：20μl×125次|20μl×500次

本试剂盒结合了饱和染料EvaGreen和抗体酶的优点，是一款适用于高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析的专业试剂盒。本品是一种2× PreMix，PCR反应液配制十分简单方便；具有分辨率高和模板高度适应性等特点。与SYBR Green不同，EvaGreen在高浓度情况下不会抑制PCR反应；可以使双链PCR产物的结合量达到饱和状态，所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green的“染料重排”现象，能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知SNP分析，未知SNP筛选，以及未知突变基因扫描和甲基化PCR分析等研究。

产品特点：
·高分辨率：采用EvaGreen饱和染料，在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率，可以区分单个碱基的变异。
·高特异性：采用抗体修饰的热启动DNA聚合酶，降低非特异性扩增，提高特异性。
·高稳定性：精心优化Buffer体系，增加了熔解曲线的稳定性，提高结果可信度。
· ROX校正：单独包装的ROX染料，使用更灵活，结果更准确。

试剂盒原理：
SYBR Green是目前被广泛应用于荧光定量PCR分析的荧光染料，但由于对PCR的抑制较严重，会被控制在较低的使用浓度，SYBR Green与双链DNA的结合处于非饱和状态，所以称为“非饱和染料”。SYBR Green的这种性质会导致在“染料重排”现象的发生，从而影响熔解曲线的分辨率，所以不能够通过熔解曲线区分扩增产物之间单个碱基之间的差异。
EvaGreen是一种同时适用于荧光定量PCR和HRM分析的新一代染料。这种染料通过一种被称为“按要求释放”的全新机制，选择性的结合双链DNA。这一机制保证了较低的PCR抑制作用，同时也允许在染料饱和浓度下进行分辨单碱基差异的HRM分析。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次
2× HRM Analysis PreMix	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存。从-20℃取出使用时，将冻存的2× HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye溶解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：
1．本产品中含有荧光染料EvaGreen，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
2．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
3．引物纯度对反应特异性影响很大，建议使用PAGE级别以上纯化的引物。
4．20μl反应体系中，基因组DNA模板的使用量一般小于100ng，并尽量保持不同反应之间有相同的模量。模板纯度，OD₂₆₀/280 1.6~2.0，OD₂₆₀/230 1.5~2.0。
5．由于HRM具有很高的灵敏性，因此在条件允许的情况下推荐使用50μl反应体系，大的反应体系可以提高反应重复性，减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
6．引物设计：较短的PCR产物可以提高HRM的分辨率；因此在设计PCR引物时，遵循普遍的原则外，尽量保持产物长度在80~120之间。SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。

操作步骤：
一、建立HRM PCR反应体系：
请注意将2× HRM Analysis PreMix和50×ROX Reference Dye避光保存。
1．溶解2× HRM Analysis PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2．建议置于冰上进行HRM PCR反应液的配制，反应体系如下：

成分	50μl体系	20μl体系	终浓度
2×HRM Analysis PreMix	25μl	10μl	1×
正向引物（10μM）	1.5μl	0.6μl	0.3μM①
反向引物（10μM）	1.5μl	0.6μl	0.3μM①
模板②	－	－	－
50×ROX Reference Dye③	－	－	－
RNase-Free ddH2O	至50μl	至25μl	－

常用体系为20 ul，在条件允许的情况下可50μl反应体系，大的反应体系可以减少实验误差对熔解曲线的负面影响。
①引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.2～0.5 μM范围内调整。
②由于HRM反应较灵敏，须尽量保持不同样本之间有相同的模板量。
③几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度如下：
  ABI 7900HT：5×（例如：5μl ROX/50μl体系）
  ABI 7500 Fast：1×（例如：1μl ROX/50μl体系)；
  Roche LightCycler 480，Qiagen Roter-Gene：不用添加。
二、进行PCR反应
建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增，引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时，建议尝试进行三步法PCR扩增反应。
两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60℃④	30sec	退火/延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）⑤

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	2min	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	10sec	变性	否
		60℃	20sec	退火	否
		72℃	30sec	延伸	是
熔解曲线分析（Melting/Dissociation Curve Stage）⑤

④请先使用60℃ 30sec进行扩增，如出现非特异性扩增，可尝试在60-66℃范围内优化，提高反应特异性。
⑤ HRM在熔解曲线分析时，一般设置为0.02～0.1℃收集一次荧光。
3．盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4．将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

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2. 降低变性温度对碱基的依赖性。
3. 提高LA-PCR的扩增效率。
4. 提高Taq DNA聚合酶的稳定性。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：将本产品加入PCR反应体系中，使其终浓度在1.0-1.7M之间即可。其他按常规操作进行即可。


名称：即用型易错PCR试剂盒
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规格：100次
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产品特点：
1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化，突变率稳定，突变没有趋向性。易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%)，详见使用手册疑难解答。
3. 比体内基因突变更快捷简单，但如果在PCR引物中设计位点，则可使产物克隆到表达载体，也可以用于体内蛋白活性的筛选。
4.可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
5. 只适用于扩增1kb以下的产物，对于1kb以上的产物，建议分段扩增。

试剂盒组成：

成分	规格
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	100μl
易错PCR Mix，10×	300μl
易错PCR专用dNTP，10×	300μl
MnCl2，5mM	300μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期为一年。

使用方法：
1.以30μL的标准PCR反应体系为例，如果反应体系不是30μL，各成分需要等按比例增加或减少。在一干净的PCR管中，加入下列成分：

易错PCR Mix,10×	3μl
易错PCR 专用dNTP，10×	3μl
MnCl2，5mM	3μl
自备DNA模板(10ng/μL)	1μl
PCR引物(自备，10μm each)	10pmol each
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	1-5U
补水到	30μl

2. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表)，然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件，一般可以先尝试下面的PCR条件：

PCR前变性	94℃ 3分钟
易错PCR	94℃ 1分钟	循环30次(见注)
	45℃ 1分钟
	72℃ 1分钟

注：易错PCR一般不需要热启动，也不需要在PCR结束后做延伸处理。

循环次数与突变几率的关系
易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率，进而决定每个PCR产物可能得突变位点数，所以所需循环数由客户根据需要改动。

PCR循环数	每个碱基突变几率	PCR终产物中的突变位点数
		100bp	200bp	400bp	800bp	1600bp
5	0.0033	0.00	0.66	1.3	2.6	5.3
10	0.0066	0.66	1.3	2.6	5.3	11
20	0.013	1.3	2.6	5.3	11	21
30	0.020	2.0	4.0	7.9	16	32
50	0.033	3.3	6.6	13	26	53

3.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。

疑难解答：
Q：易错PCR与定点突变PCR有什么区别？
A：定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。它需要预先知道靶基因的序列。易错PCR是一种随机突变，它不需要预先知道靶基因的序列(引物结合部分除外)，但需要后续的筛选方法筛选自己所需要的突变。
Q：易错PCR的错误率是多少？
A：易错PCR的突变率为0.66%(±0.13%)，对500bp的PCR产物，相当于有4%的PCR片段为野生型，12%的含一个突变，20%的含两个突变，22%的含三个突变，18%的含四个突变，12%的含五个突变，12%的含六个或更多突变。
Q：如果需要每个核苷酸有高于0.66%的突变率，如何办？
A：可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板，否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板，但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。

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