JN0001 一步定向无缝克隆试剂盒

我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括一步定向无缝克隆试剂盒在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特别提示：包括一步定向无缝克隆试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步定向无缝克隆试剂盒
英文名称：One step directed seamless cloning Kit
产品货号：JN0001
产品规格：20次|100次

  本试剂盒可以不依赖于连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用同源重组的方法，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单，PCR产物一步定向克隆，目的片段与载体无缝连接，反应时间短至20分钟，阳性率达到95%以上，让您轻松完成实验。

试剂盒组成：

组份	JN0001-20次
BalbRec 重组酶	20μl
10×重组缓冲液	50μl

收到后请立即离心；可在-20℃长期保存，避免反复冻融

产品特点：
1、无酶切位点限制，无多余序列；
2、PCR产物无需酶切，一步克隆；
3、克隆效率高，阳性率＞95%；
4、省时省力，操作简单；
5、多片段定向拼接，妙用无穷；
6、定向克隆，任意载体。

使用方法：
A.线性化载体的获得

线性化载体可以通过两种方法获得，不管采取哪种方法，zuì终线性化载体的 浓度需>15ng/μl。(高浓度的载体有利于提率)。
1、酶切选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可，并且5′端突出，3′端突出或平末端均适用本Kit。
2、PCR 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp 左右，一般载体长度均大于3kb，建议用高保真的聚合酶扩增（推荐使用 百奥莱博pfu DNA 聚合酶，货号：JN0016）。为了避免模板质粒DNA对后续 试验的影响，建议载体酶切后再用PCR扩增，自连背景更低，阳性率更高。

B.目的片段获得
目的片段通常通过PCR获得。引物设计要保证目的片段两端有至少15bp序列与 线性化载体的两端一致，特殊应用引物设计请参照技术手册。为保证PCR扩 增的特异性及灵敏度，请尽可能选用pfu等高保真酶（推荐使用百奥莱博pfu DNA聚合酶，货号：JN0016）。PCR每条引物长度至少在35-40bp，包括5′ 端与载体同源的15bp以及目的片段特异性序列20-25bp，（注意事项：如果是 表达载体克隆构建，引物设计完全后，请注意检查读码框的正确）。引物设 计方法：使用BalbRec PCR一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）时，引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引物要加上15-18bp的载体同源序列。
载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：
(1)载体酶切后是5"端突出或平末端，则引物上的同源序列包括5"端突出部分的序列；
(2)载体酶切后是3’端突出，则因无上的同源序列不包含突出部分。（如下图，红色碱基为希望保留原有的酶切位点所额外添加的碱基，不计算在15bp之内。
注：15bp同源序列不要求严格从载体zuì末端一届碱基计算，这是载体末端非同源序列将会被删除，同时导致重组效率的下降。当非同源序列达到20bp时，效率下降一半。

BalbRec 一步定向克隆试剂盒（无缝克隆）引物设计方法

C.目的片段与载体的重组
1.将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中 进行重组反应
2.混匀后在37℃放置20分钟;
3.立即进行转化，剩余连接液可保存在4℃或-20℃待用。（注意：1.目的片段与载体的摩尔比在3：1-10：1之间，摩尔比低于3：1效率会降低 2.反应时间在20-40分钟，时间太长不利于重组反应）

D.转化
建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5X106 cfu/μg.
1.冰上融化一管100 μl的DH5a感受态细胞，轻弹管壁使细 胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育45分钟。
2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。
3.加入500μl S℃液体培养基，37℃孵育45-60分钟。
4.5k离心3分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

E.阳性克隆鉴定
一般的，我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定(推荐使用百奥莱博2x specificTM PCR MasterMix 货号：JN0034)。
鉴定引物的选择：为避免假阳性结果，我们建议一条引物为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。

常用反应体系

试剂	体积
10×重组缓冲液	2μl
BalbRec 重组酶	1μl
线性化载体（>15ng/μl）	N
插入片段	N
ddH2O	至20μl

注：载体与目的片段的摩尔比在1:3～1:10之间，如果摩尔比低于1:3，转化效率会下降。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

根据您的关注的一步定向无缝克隆试剂盒，您可能还对以下产品有需求：



名称：DNA快速连接试剂盒
货号：BTN70602
规格：100次
 DNA连接反应通过T4连接酶催化双链DNA的3′-OH和5′-P形成磷酸二脂键而将DNA共价连接在一起。被连接的DNA末端可以是粘末端(例如限制性切割EcoR I产生的末端)，也可以是平末端(限制性切割Sma I产生的末端)。Pheiffer等人发现PEG可以促进T4 DNA连接酶催化的连接反应[NAR，11，7853-7871，1983]，连接反应只需十分钟即可完成。

产品特点：
1.超快，整个连接反应只需要室温5分钟左右，反应液可以直接用于转化实验。
2.，溶液配方经过优化，每ug 插入DNA连接转化得到的重组子可达107左右。
3. 既可用于平末端连接，也可用于粘末端连接，包括PCR产物与T载体的连接。
4. 简单，客户只需要提供载体和插入片段即可。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	500μl
溶液B	100μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：连接反应
1.在无菌的离心管中严格按下表顺序加入列各成分(以10μl 体系为例):

成分	阴性对照管	样品管
溶液A	5μl	5μl
插入片段(自备)	-	0.2-0.5μg(注)
载体(自备)	50ng	50ng
无菌水	补水到9μL	补水到9μL

 注：插入DNA片段的摩尔数zuì好是载体的3-10倍，如果载体长度为3000bp，则所需插入DNA片段折合成重量(ng)＝(插入DNA片段bp 数×50 ng×N)÷3000bp。N就是自己选定的插入DNA片段与载体的摩尔比。
2. zuì后在每管中加入1μl溶液B，轻柔吹打混合均匀后用微量离心机将液体全部甩到管底。
3.室温放置至少5分钟，zuì长可以放置过夜。
4. 70℃保温10分钟。此步可以灭活有关的酶，否则转化效率有所降低。
5. 根据使用的转化方法，每管各取适量用于转化实验，余下的放置在-20℃保存。

二：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
6. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
7. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀。
8.在冰上放置30分钟。
9. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
10. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
11. 将100μl 复苏涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(根据载体情况也可能需要加上X-gal和IPTG)。
12.室温4,000rpm离心剩余的900μl 复苏细胞5分钟，弃去800μL上清，用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB 琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
13. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
14. 倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR 回收片段的质量。
15. 按常规方法筛选重组子。

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