BTN80915B 超级杂交液(含50%甲酰胺)

超级杂交液(含50%甲酰胺)的品牌是百奥莱博，是优质的探针标记及检测产品，本制品用于生化实验研究等领域，超级杂交液(含50%甲酰胺)是我司众多优质探针标记及检测之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括超级杂交液(含50%甲酰胺)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：超级杂交液(含50%甲酰胺)
英文名称：Super hybrid solution(with 50% formamide)
产品货号：BTN80915B
产品规格：100mL

核酸杂交一般是指用一种标记的核酸探针与印迹膜上的核酸进行杂交，由此检测印迹膜上是否存在与探针同源的核酸分子(靶分子)。核酸杂交是分子生物学的基本技术之一，应用非常广泛。由于核酸杂交效率受印迹膜种类、杂交温度、探针浓度、杂交液离子强度、杂交液pH及杂交液粘度等因素影响，用户自己摸索和优化相关条件非常繁琐，因此本公司开发了本产品，其操作流程如下：


产品特点：
1. 既可用于Southern杂交(靶分子为DNA)，也可用于和Northern杂交(靶分子为RNA)，还可以用于菌落杂交，基因芯片等杂交。
2. 既可以用于同位素探针的杂交，也可以用于非同位素探针的杂交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探针，也可以使用RNA探针(包括RNA Oligo)
4.含多种能够促进杂交的聚合物，使杂交反应能在6～12小时完成，而常规杂交反应一般需要12～24小时。
5.含多种封堵剂，能阻印迹膜对探针分子的非特异性吸附，能有效降低背景信号，延长曝光时间以便检测到低拷贝的RNA(Northern)和单拷贝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使杂交在较低温度就可以完成，适合Tm 较高的分子杂交(如RNA-RNA和RNA-DNA杂交)。
7.跟各种常用的印迹膜兼容，包括硝酸纤维素膜和尼龙膜。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。本产品属于高盐溶液，低温下产生沉淀，必须在65℃加热溶解并充分摇匀后才能使用。

使用方法：

一、根据探针和靶分子的不同，分别按下面不同情况计算杂交分子的Tm 值
1. 对DNA-DNA杂交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
说明：L是探针或靶分子的长度(用两者中zuì短的一个)
GC%是探针或靶分子中的GC 百分比(用两者中zuì短的一个)
Na+浓度是本产品中Na+的浓度，为0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 对DNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 对RNA-RNA杂交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 对Oligo探针杂交，Tm=GC 数量×4℃+AT 数量×2℃。

二、确定zuì佳杂交温度(预杂交温度跟杂交温度应该一样)
1. 对于大于200bp的DNA-DNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃，一般选择68℃。
2. 对RNA-RNA或DNA-RNA杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低15-25℃。如果这样计算出的杂交温度很高(如高于70℃)，则RNA容易降解，所以zuì好选用含甲酰胺的超级杂交液(B型本产品)，以便能在42℃完成杂交。
3. 对Oligo探针的杂交，zuì佳杂交温度一般比Tm低5℃。由于Oligo较短，更容易受各种因素影响(如错配率、修饰碱基比例等)，所以zuì佳温度需要适度摸索和优化。

三、确定洗膜温度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此条件下的zuì佳洗膜温度比Tm低5-12℃，一般情况下可以在55℃进行洗膜。Oligo探针可以室温洗膜。

四、预杂交步骤
预杂交就是用不含探针的本产品跟印迹膜进行孵育，其目的是用所含的非特异性DNA分子(鲑精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物将印迹膜上会非特异地吸附探针分子的位点封闭，否则这些位点会吸附标记的探针，造成高背景。
1. 将结合了靶分子的硝酸纤维素印迹膜或尼龙印迹膜浸泡于自备的6×SSC溶液中，使其充分湿润。
2. 将湿润的印迹膜置于一塑料杂交袋中(塑料袋zuì好预先封口，再剪掉一角，留一个小口)，按每平方厘米印迹膜加0.2mL超级杂交液的比例沿小口加入超级杂交液，然后用塑料封口机将口封牢。
3. 将此塑料袋浸没入温度设定在zuì佳杂交温度的恒温水浴中或杂交炉中，保温1-2小时，延长到12-16小时亦可。注意保温过程中塑料袋应在不停的摇动状态中，使超级杂交液与印迹膜充分接触。

五、杂交步骤
1. 如果标记的探针是双链核酸，则需经变性处理。具体操作是将探针样品在沸水浴中加热5分钟，然后迅速置冰浴中。如果是单链DNA或RNA探针，则不需变性，直接使用。
2. 将单链探针或变性后的双链探针加入到完成了预杂交的杂交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探针后用热封机封口)。探针的加入量视探针标记效率而定，一般要求终浓度不能低于1-2 ng/mL。如果检测基因组中的单拷贝基因，探针的加入量应加大，而对于检测克隆的基因片段，则探针的量可减少。如果是放射性探针，应将此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免杂交袋发生遗漏、污染工作环境。
3.在选定的杂交温度下继续保温，时间一般为6-12小时。

六、洗膜步骤。注意在下面的所有操作过程中，一定不要使印迹膜干燥。
此步是将与印迹膜非特异结合的探针分子洗去而只留下特异结合的探针分子。由于非特异性杂交的杂交分子解链温度较低，热稳定性较差，在一定的温度和较低的离子强度下，即可洗掉。
1.杂交完毕，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探针的杂交液。此含探针的杂交液可以多次使用再倒弃。
2. 剪开杂交袋，用镊子取出印迹膜，浸没于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室温下振荡漂洗15分钟。
3. 重复上步操作一次。
4. 将印迹膜转移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在计算好的洗膜温度下振荡漂洗30分钟至1小时。
5. 重复上步操作一次。如果是同位素标记探针，则需要重复至用盖革计数器在无核酸区域检测不出放射信号为止。
6. 将印迹膜转移到滤纸上，吸去表面液体后印迹膜即可用于后续检测。

疑难解答：
问题一：高背景(有或没有杂交信号)
解决方案：将放射性探针的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；将非放射性探针的终浓度降低到30 ng/mL以下；将探针长度控制在200–800 核苷酸；减少杂交时间；适当提高杂交温度。
问题二：没有杂交信号或杂交信号非常弱
解决方案：杂交过程中应应该连续振荡，不应该有气泡，避免印迹膜变干。将放射性探针活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性标记探针的终浓度；适当降低杂交温度。

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名称：5′末端同位素标记试剂盒
货号：BTN131036
规格：20次
本产品为DNA 5′末端标记系统，利用T4 Polynucleotide Kinase(T4多聚核苷酸激酶)和［γ-32P］ATP 对粘性末端或平末端的DNA或RNA的5′末端进行标记反应。原理如下：


产品特点：
1. 使用本试剂盒之前，不需要对 5′末端的磷酸基团进行去磷酸化处理，因为使用的kinase 能使5′末端的磷酸与[γ-32P]ATP的γ-磷酸进行交换。
2. 合成的单链或双寡核苷酸的5′末端游离的OH基团都能通过Kinase反应被标记(或者只是简单的磷酸化)。
3. 提供的两种反应液使交换反应和磷酸化反应都能进行，均能得到大于106 cpm/pmol(5′-end)的比活性。

试剂盒组份：

成分	规格
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	20μl
5×交换反应缓冲液	100μl
10×磷酸缓冲液	50μl
Control DNA	20μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、交换反应
1. 实验前需自备的试剂：7 M 醋酸铵、乙醇、70%乙醇等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的5′磷酸化DNA片段	14μL(≤5 pmoles的5′末端)
5×交换反应缓冲液	5μL
[γ-32P]ATP	5μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

注：5 pmoles的5′末端约等于0.17μg的长100bp的双链DNA。
3. 37℃反应30分钟。
4. 70℃加热5～10分钟使酶失活。
5. 加入10μl的7 M CH3COONH4(pH4.5)。如使用CH3COONa做乙醇沉淀时使其终浓度达300mM。
6. 加入87.5μl(2.5倍)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
7.离心回收沉淀，用 70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
8. 用适当 Buffer 溶解沉淀。
注：通过第5～8 步操作几乎可以除去大部分未反应的[γ-32P] ATP，如要完全将其除去时，乙醇沉淀后用凝胶过滤等方法精制即可。如需用苯酚抽提除去蛋白质时，请在第8 步之后进行。

二、磷酸化反应标记

A. 去磷酸化反应
1. 实验前需自备的试剂：TE 饱和酚/氯fǎng、3 M NaCl 、乙醇、70%乙醇、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)等
2.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	133μL(≤10μg)
1M Tris-HCl，pH8.0	15μL
牛小肠碱性磷酸酶(CIAP，10～20U/μL)	2μl
灭菌的超纯水	补足到150μL

3. 50℃反应30分钟。
4. 加入150μl的TE 饱和酚/氯fǎng/异戊醇(25：24：1)，充分混匀。
5.离心，取上层(水层)移到另一个微量离心管中。
6. 重复操作 4～5。
7. 加入7.5μl的3 M NaCl(zuì终浓度150mM)。
8. 加入375μl(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9.离心回收沉淀，用 1mL 70%的冷乙醇清洗后，沉淀真空干燥。
10. 使用 20μl的TE Buffer 溶解沉淀。

B. 磷酸化反应(前反应)
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
自备的DNA片段	20.5μL(≤5 pmoles的5′末端)
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

三、合成DNA 寡核苷酸的标记
1.在微量离心管中制备下列反应液：

成分	加入的体积
Oligonucleotide DNA with free 5′-OH(5～10 pmoles)	≤3μL
10×磷酸缓冲液	2.5μL
[γ-32P]ATP	1μL
T4 多聚核苷酸激酶(10U/μL)	1μL
灭菌的超纯水	补足到25μL

2. 37℃反应30分钟。
3.下面的操作与交换反应的第4-8 步操作相同。

四、合成DNA 寡核苷酸的标记
当掺入水平很低的时候，需要使用本步骤，即通过体积排阻色谱或过滤试剂盒除去未反应的标记。Sephadex G-50 层析柱(需另购)对于去除未掺入的dNTPs效果很好，它还能大幅减少小于20个碱基的DNA 寡核苷酸和小于20bp的双链DNA的量。使用之前需要在70℃加热5～10分钟以使T4 多聚核苷酸激酶失活。Sephadex G-25 层析柱可以用来纯化长度不小于10个碱基的寡核苷酸。

注意事项：
1.缓冲液可在室温融解。融解后立即置于冰中，使用前充分混匀。
2. 5×交换反应缓冲液于-20℃冻结保存时会有白色浑浊出现，但不影响反应效果。
3.酶切得到的DNA片段需经乙醇沉淀等方法纯化。
4. 当用于交换反应的DNA在5 pmoles以上(约1,000bp以上)时，标记效率有时会低于106 cpm/pmol。
5. 如果交换反应所用 DNA低于500bp时，标记效率有时会有所降低。
6. 若不进行放射线标记，仅使用本试剂盒做5′末端磷酸化反应时，反应体系中的［γ-32P］ATP可用5μl的10mM ATP 代替。
7. 磷酸化反应时的［γ-32P］ATP可用［γ-35S］ATP 替代。

使用举例：
按照使用方法中交换反应和合成DNA 寡核苷酸的标记的实验操作，取λ-BstP I，λ-Hpa I，λ-EcoT22 I 各3 pmols，用［γ-32 P］ATP 通过正向磷酸化反应或交换反应标记。各DNA片段的放射自显影结果如下所示：


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