MT0005 一步法microRNA反转录试剂

一步法microRNA反转录试剂是高品质的基因结构和功能产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，本品质量稳定，价位合理，需要一步法microRNA反转录试剂等基因结构和功能产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括一步法microRNA反转录试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步法microRNA反转录试剂盒
英文名称：One Step microRNA cDNA Synthesis Kit
产品货号：MT0005
产品规格：25T|100T

由于miRNA(microRNA)分子序列较小，仅20nt左右，没有真核生物特有的Poly(A)尾巴结构，采用传统Oligo dT引物和随机引物很难获得从miRNA到cDNA的反转录产物。目前普遍采用的解决方案有两种：特异性反转录引物（下图A所示）、两步加A法反转录方案（下图B所示）。Biorab公司开发出一套全新的一步法miRNA反转录试剂盒，可以对成熟的miRNA同时完成Poly(A)反应和反转录反应，直接获得含有特异性tag和15(T)的cDNA产物（下图C所示）。该方法使得miRNA反转录与mRNA的反转录一样轻松,直接将提取的microRNA与反应缓冲液混合物混合并置于PCR仪上1小时即可获得高浓度的、包含所有miRNA分子的cDNA产物,获得的cDNA产物适合于采用SYBR Green染料法进行RealTime PCR进行定量检测。



产品组成：

组分	MT000(25T)	MT0005B(100T)
4×One step miRNA RT Solution	125μl	500μl
10×miRNA RT Primer	50μl	200μl
RNase Free H2O	1ml	1ml×2

储存：请置于-20℃，可保存2年，避免反复冻融。
注：如4×One step miRNA RT Solution出现沉淀属正常现象，可用手捂化，混合均匀后使用不影响实验结果。

特别说明： 10×miRNA RT Primer 引物为5"-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3"，定量扩增用特异性上下游引物进行扩增，下图2是以 hsa-miR-21 为实例说明特异性上下游引物的设计方法（Biorab的microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒提供所有 miRNA 检测，货号：MTAXXXXX，所有引物均经过设计优化，详细请于引物列表中查询。如果您研究的miRNA分子不在列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计）。

图1：技术原理图：


图2：hsa-miR-21实例设计原理：


操作方法：

1．按以下组分配制反转录反应液：

模板	miRNA	0.01-0.1μg
	Total RNA	0.1-2μg
4×One step miRNA RT Solution		5μl
10×miRNA RT Primer		2μl
Rnase-Free H2O		Up to 20μl

2. 在PCR 仪上按以下条件进行反应：
  37℃——————60min
  95℃——————5分钟
3．获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。使用该试剂盒反转录所得 cDNA 产物包含了样品中所有miRNA 反转录产物，可用于多个基因的检测分析，可使用内参基因进行定量矫正。内参基因可选择使用RNU6B miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01501)，适用于来源于人和鼠等哺乳动物的样品；RNU44 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01502)、 RNU48 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01503)，适用于来源于人的样品；SnoRNA135 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01504) 、SnoRNA202 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01505)适用于来源于鼠的样品。Biorab 提供的内参扩增引物浓度均为 10μM，每 20μl 反应体系中加入0.4-0.8μl。
根据机型选择步骤A或B，配制反应体系：
步骤A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix	4μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4-0.8μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。
步骤B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix	4μl	1×
PCR Forward Primer(10μM)	0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)	0.4-0.8μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

4．进行 Real-Time PCR 反应，通常采用两步法，程序如下：

步骤	加入量	终浓度	循环数
Stage 1：	95℃	15分钟
Stage 2：	95℃	5s
	60℃	30s	30cycles
Stage 3：	Dissociation analysis

注意：使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子，过多的循环数会造成性降低。推荐的循环数为 30 个，在检测低样品浓度时可将循环数调整到35 个。
5．扩增结果分析和数据处理：
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。


根据您的关注的一步法microRNA反转录试剂盒，您可能还对以下产品有需求：



名称：DOP-PCR试剂盒
货号：BTN111109
规格：50次
DOP-PCR即简并寡聚核苷酸引物PCR，是扩增全基因组的方法之一，它利用中间含有6个随机碱基的22nt引物，通过两轮PCR(轮低温复性，第二轮高温复性)而将模板DNA扩增。DOP-PCR扩完整基因组的效率不如利用phi 29 DNA聚合酶的MDA，但在扩增高度降解的痕量DNA 方面具有巨大，在法医鉴定领域具有重要应用。本产品就是在DOP-PCR基础上进行优化而开发。

产品特点：
1. 专门用于高度降解的DNA，方便，含有除模板DNA和引物以外的所有成份，简化了准备工作。
2. 优化的引物浓度，使自连序列和非模板相关序列的合成。
3. 使用高保真酶，降低突变率。
4. 长度在300-1700bp 之间，平均500bp左右。
5. 模板基因DNA 用量一般为10-100pg。
6. 所得PCR产物可用于STR 多重扩增、比较基因组杂交、单染色体文库构建、基因组图谱研究等。

试剂盒组成：

成分	规格
DOP-PCR Magic Mix	750μl
DOP-PCR引物(20pmol/μL)	250μL
超纯水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存，保存期限为12个月。不要反复冻融。

使用方法：

1.在一干净的PCR 管中，加入下列成分：

成分	阴性对照	样品
DOP-PCR MagicMix	25μL	25μL
基因组DNA模板(自备)或单个细胞	不加	10-100pg(或一个单个细胞)
DOP-PCR引物(20 pmol/μL)	5μl	5μl
补水到	50μl	50μl

2. 放入PCR仪中按下列参数进行DOP-PCR。

预变性	95℃	5min
轮PCR(12个循环)	94℃	1min
	30℃	1.5min
	72℃(30℃升到72℃的时间设定为3分钟)	3min
第二轮PCR(35个循环)	94℃	1min
	62℃	1min
	72℃(每次循环后此步的保温时间延长14秒)	2min
延伸	72℃	7min
	4℃	Forever

3.结束后取5-10μl直接上样电泳(不需要额外再加DNA上样液)，红色染料电泳速度相当于50bp DNA片段。DOP-PCR产物的长度一般在300-1700bp之间。
4. 所得DOP-PCR产物可以用于后续PCR检测或其他分析。

关注一步法microRNA反转录试剂盒，的同时，为您推荐更多您可能感兴趣的产品：

货号	名称	规格
WE0241	二代测序接头引物试剂盒(Illumina平台 Index Primer1-12)	24次|96次
ZN0030	ADMR mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0054	Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0117	Bag-1 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0184	CARD10 mRNA原位杂交试剂盒	100T
ZN0197	Caspase-7 mRNA原位杂交试剂盒	100T

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