WE0272 Ni琼脂糖凝胶

北京百奥莱博供应的Ni琼脂糖凝胶用于科学研究，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多Ni琼脂糖凝胶等蛋白质研究产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括Ni琼脂糖凝胶在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Ni琼脂糖凝胶
英文名称：Ni-Agarose Resin
产品货号：WE0272
产品规格：10ml

  该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。

支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径：50-160μM

注意事项：
1、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT或EDTA。
2、整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
3、为提高纯化效率，先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的zuì佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑(20-500 mM)洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
4、为避免柱子被堵塞，请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45μM过滤器过滤。建议将裂解液进行离心，或者使用0.45μM过滤器过滤。
5、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

使用方法：

I 缓冲液的准备
1、可溶性蛋白纯化缓冲液配方：

成分	Tris-HCl(PH 7.9)	咪唑	氯化钠
Soluble Binding Buffer	20 mM	10 mM	0.5 M
Soluble Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M

2、包涵体蛋白纯化缓冲液配方：

成分	Tris-HCl(PH 7.9)	咪唑	氯化钠	尿素/盐酸胍
Inclusion Body Binding Buffer	20 mM	5 mM	0.5 M	8 M/6 M
Inclusion Body Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M	8 M/6 M

II 组装层析柱
1、将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)本实验是通过重力作用使溶液流出，如果溶液不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使其流出。
2、向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

III 可溶性蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml细菌裂解液，超声裂解菌体。10000×g离心10分钟后，收集上清。
2、将上清液过柱，流速为10倍柱体积/小时。
3、使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
4、使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
5、洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。

Ⅳ 包涵体蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml 细菌裂解液，超声裂解菌体。
2、离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer 中(如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5 mM 磷酸酶抑制剂混合物)。
3、重复操作2，直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)。
4、将沉淀重悬于Inclusion Body Binding Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。
5、10000×g离心20分钟，将上清以孔径为0.45μM的滤膜过滤。
6、将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。
7、使用15倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
8、使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
9、洗脱后，依次使用3倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低Binding Buffer中的咪唑浓度(5 mM或更低)。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5，pH5.9或pH4.5)。

Ⅴ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用2倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2、使用1倍柱体积2% SDS冲洗。
3、依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。
4、使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5、使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6、使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7、封柱后2～8℃保存。
8、再次使用前，需先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。

储存条件：2～8℃，避免冷冻

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货号	名称	规格
BTN140652	30mL亲和层析柱	30mL
BTN131045	辛甲基硫吡喃葡萄糖苷(OTG)	5g
BTN81212B	一站式蛋白质非变性PAGE电泳套装(中pH)	30次
BTN100214	预混型BCIP/NBT溶液	250mL
YT044	组织线粒体纯化试剂盒	50-100次
WE0288	SDS-PAGE上样缓冲液(还原，5×)	5×2ml
SNM438	PVDF膜(0.45μm)	15cm×20cm

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名称：蛋白marker(3.3～20.1kD)
货号：BTN70102A
规格：15次
本产品为蛋白质电泳标准系列，为已知的标准蛋白质混合物，在SDS-PAGE时可以作为分子量标准，估计其他蛋白质的分子量大小。

产品特点：
1．简单，不需要自己单独购买各种蛋白质配置。
2．本产品有粉末型和溶液型两种，十分稳定。
3．本系列三种产品涵盖从 3.3 KD-200 KD的分子量范围。

所含成分及其分子量		A型	B型	C型
肌球蛋白重链	200.0KD			有
钙调素结合蛋白	130.0KD			有
兔磷酸化酶B	97.4KD		有	有
牛血清白蛋白	66.2KD		有	有
兔肌动蛋白	43.0KD		有	有
牛碳酸酐酶	31.0KD		有
人生长激素	22.0KD
大豆胰蛋白酶抑制剂A	20.1 KD	有	有
鸡蛋清溶菌酶	14.4KD	有	有
人工合成肽1	7,823D	有
人工合成肽2	5,856D	有
人工合成肽3	3,313D	有

产品组成：

成分	A型	B型	C型
蛋白分子量标准A型(低分子量)	15T	-	-
蛋白分子量标准B型(中分子量)	-	20T	-
蛋白分子量标准C型(高分子量)	-	-	10T
1×SDS-PAGE上样液	0.5ml	0.5ml	0.5ml
说明书	1份	1份	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期两年。

使用方法：

一、干粉型的使用：
1．开封后将1×SDS-PAGE上样液加入到样品管中溶解蛋白质粉末，各分子量标准所需的1×SDS-PAGE上样液的体积如下:
低分子量标准(BTN70102A)需要150μL。
中分子量标准(BTN70102B)需要200μL。
高分子量标准(BTN70102C)需要100μL。
2．沸水浴中加热 5分钟。
3．短暂离心后将溶液按每管10μL的体积分装到多个塑料离心管中，置-20℃长期保存。
4．使用时每次取一管，室温放置直到液体融化后，沸水浴中加热3～5分钟，即可上样进行SDS-PAGE电泳。BTN70102A型推荐使用Tricine-甘油SDS-PAGE胶、BTN70102B 推荐使用12%的分离胶、BTN70102C 推荐使用8%的分离胶。
5．电泳后进行考马斯亮蓝G-250染色，染色后出现的带型见上表。

二、溶液型的使用：
1．将溶液按每管一次电泳的用量分装到塑料离心管中冻存，每次只用一管，这样避免反复冻融。
2．使用时取一管室温放置直到液体融化。
3．沸水浴中加热3～5分钟后趁热上样并进行SDS-PAGE电泳。BTN70102A型推荐使用Tricine-甘油SDS-PAGE胶、BTN70102B 推荐使用12%的分离胶、BTN70102C 推荐使用8%的分离胶。
4．电泳后进行考马斯亮蓝G-250染色，染色后出现的带型见上表。

疑难解答：
1.分子量不同，SDS-PAGE的分离胶和浓缩胶浓度不同。需要自己根据具体情况调整。
2.电泳之后可将胶进行染色观察，如果使用传统配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择本公司的一步式蓝色PAGE染液(BTN61204)，该产品具有染色快，，灵敏性高等物点，是常规蛋白染色液的替代品。

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