JN0173 预染彩虹蛋白Marker

我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括预染彩虹蛋白Marker在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特别提示：包括预染彩虹蛋白Marker(10～170kD)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：预染彩虹蛋白Marker(10～170kD)
产品货号：JN0173
产品规格：50μl

  本产品由10条预染蓝色，橙色和绿色的蛋白组成，分子量从小到大分别为10kD，15kD，25kD，35kD，40kD，55kD，70kD，100kD，130kD，170Kd。 其中70kD蛋白为橙色，10kD蛋白为绿色，其余为蓝色。本产品可以作为标准蛋白分子量参照,适用于蛋白SDS-PAGE电泳和western blot.

使用建议：本产品无需处理，可直接使用于PAGE电泳及WesternBlot实验。薄胶 (0.75-1mm)，2μl/次；厚胶(1.5mm)，3μl/次。

缓冲液配方：50mM Tris-H3PO4 (pH 7.5 at 25℃), 1mM EDTA, 2% SDS, 10mM DTT,1mM NaN3 and 25% glycerol.

储存条件：-20℃，避免反复冻融，有效期12个月。

根据您的关注的预染彩虹蛋白Marker(10～170kD)，您可能还对以下产品有需求：



名称：预混型BCIP/NBT溶液
货号：BTN100214
规格：250mL
本产品是在BCIP/NBT底物显色试剂盒(BTN81224)的基础改良而得的升级产品。

产品特点：
1．含有BCIP和NBT 两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。
2．在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物(包括分开提供的BCIP/NBT溶液)一样的灵敏度。
3．稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。
4．可用于Western Blot。

储存条件：常温运输和保存(避光)，有效期一年。

自备试剂：Western印迹膜洗膜液(BTN81211)或TBST缓冲液。

使用方法：
1．按常规方法进行Western 印迹膜杂交，直到跟二抗-AP 复合物保温这步结束。
2．用Western 印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。注意：可以用TBST缓冲液代替Western 印迹膜洗膜液。
3．用水迅速冲洗一次。
4．将印迹膜转移到本产品中(每cm2印迹膜需要0.1mL本产品)，室温平缓摇晃5-30分钟显色。37℃可加速反应。
5．细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后(一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关)迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。数分钟后需要换水，共三次。
6．用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。

名称：SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)
货号：YT052
规格：2ml
本品是一种经过改良的以溴酚蓝为染料，6倍浓缩的蛋白上样缓冲液，可以用于常规的SDS-PAGE蛋白样品的上样。

注意事项：
1. SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)中含少量DTT，有轻微刺激性气味，但不含剧毒的巯基乙醇。
2. SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X)必须完全溶解后再使用。

储存条件：-20℃，有效期一年。


名称：His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)
货号：WE0266
规格：5ml
  该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用于包涵体蛋白的纯化，使用方便，快捷。

镍柱参数：
支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径：50-160μM

试剂盒组成：

组份	5ml
Ni-Agarose Resin	5ml
Bacterial Protein Extraction Reagent	65ml
Urea	365 g
1 M Tris-HCl(pH7.9)	15ml
1 M Imidazole	65ml
3 M NaCl	120ml
Protease Inhibitor Cocktail	700μl
吸附柱(12ml)	1套

保存条件：Protease Inhibitor Cocktail，-20℃；Ni-Agarose Resin，2～8℃，避免冷冻；其它组分，2～8℃

注意事项：
1、在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于包涵体蛋白的纯化，如需纯化可溶性蛋白，请选择我公司的可溶性蛋白纯化试剂盒，货号为WE0267。
2、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT和EDTA。
3、整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4、为提高纯化效率，先确定Binding Buffer和Elution Buffer中Imidazole(咪唑)的zuì佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的Imidazole(咪唑)(10-500 mM)洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
5、请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22μM或者0.45μM过滤器过滤。
6、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。
7、如果有些蛋白采用尿素的溶解效果不好，可以采用盐酸胍进行溶解。

使用方法：

I 缓冲液的准备
包涵体蛋白纯化缓冲液配方：

组份	Tris-HCl(pH7.9)	Imidazole	NaCl	Urea
Binding Buffer	20 mM	5 mM	0.5 M	8 M
Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M	8 M

II 组装层析柱
1、将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
3)本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2．向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

III 包涵体蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入2ml细菌裂解液(每1ml细菌裂解液中请预先加入10μl 蛋白酶抑制剂混合物)，如有需要可以超声裂解菌体。
注意：
1)当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNase I和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μl DNase I(1000U/ml)，2μl Lysozyme(50 mg/ml)，DNase I和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(WE0214S)、 DNase I(WE0213S)，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
2)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。zuì终菌液变清即可。
2、10000×g，4℃离心15分钟，分离上清和沉淀，并收集沉淀。
3、将沉淀重悬于Binding Buffer中，尽量混匀使包涵体充分溶解。
4、10000×g离心20分钟，收集上清。
注意：建议将离心后的上清以孔径为0.22μM或者0.45μM的滤膜过滤。
5、将上清负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
注意：
1)本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，再将处理好的上清负载上柱。该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子，但是筛板放入柱子后不易取出。
2)通过控制加入的上清(菌体裂解液)的速度来控制流速。
6、使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
7、使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
注意：通过蛋白监测仪监测，洗脱峰可以分管收集，每1ml收集1管。
8、洗脱后，依次使用5倍柱体积的Binding Buffer，5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
注意：
1)在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，可以降低Binding Buffer中的咪唑浓度(比5 mM更低)。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5，pH5.9或pH4.5)。
2)如果是分段梯度洗脱，zuì大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500 mM，则使用浓度为500 mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第8步的操作。

Ⅳ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2、使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
3、依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
4、使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5、使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6、使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7、2～8℃保存。
8、再次使用前，需先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4 再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。

储存条件：-20℃

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