BTN11-290 猪高致病性蓝耳病毒RT-PCR检

猪高致病性蓝耳病毒RT-PCR检由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品用于生化实验研究等领域，本品质量稳定，价位合理，需要猪高致病性蓝耳病毒RT-PCR检等病毒PCR检测试剂盒产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括猪高致病性蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：猪高致病性蓝耳病毒RT-PCR检测试剂盒
英文名称：PRRSV RT-PCR Kit
产品货号：BTN11-290
产品规格：50次

猪蓝耳病是一种高致病性的传染病，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠期母猪和 1 月龄的仔猪zuì易感染，主要的症状为母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎及呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） 变异株引起的一种急性高致病性传染病。仔猪发病率达 、死亡率达 50% 以上，母猪流产率达30%以上。由于高致病性 PRRSV 毒力强、传播速度快、发病率高、病死率高，到目前为止，蓝耳病已蔓延到，每年都有巨大的经济损失，对养猪业构成了严重的威胁。因此建立一种快速、高灵敏度的诊断高致病性猪蓝耳病的方法具有很重要的社会和经济价值。本产品就是针对这一需求开发的RT-PCR产品。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需要提供病毒RNA模板。
2. 传统PRRSV的鉴定方法，如免疫荧光实验方法、检测抗体的 ELISA血清病毒中和实验、免疫组化、间接免疫荧光试验、免疫过氧化酶单层实验等血清学方法，具有一定的局限性并不能够区分高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病。因为高致病性蓝耳病在1590～1591bp之间与低致病性蓝耳病相比较有连续的87 bp的碱基缺失，所以高致病性的扩张产物为 460 bp明显低于低致病性蓝耳病的547 bp，通过此方法即能够快速判断毒株的类型又能够区分其是否为高致病性。
3. 两管式RT-PCR，一次RT反应产物可以作为多次PCR的模板。本试剂盒提供10次的RT反应试剂和50次的PCR试剂。
4. 引物经过优化，特异性高，引物是根据高致病性蓝耳病基因的保守序列设计，产物长度为460 bp。
5. PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。

产品组成：

组分	编号	规格(50T)
MMLV逆转录酶 (含RI)	BTN80206A	20 μL
RT Buffer（含dNTP）	BTN80206B	60 μL
RNase-free水	BTN80403	10mL
PCR MagicMix 3.0	BTN90805	1.5mL
PRRSV阳性对照	BTN10101011	100 μL
PRRSV专一性引物一（正向引物）	yw1010	100 μL
PRRSV专一性引物二（反向引物）	yw1011	120 μL
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期12个月。

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一、简介：
本试剂盒针对诺如病毒通用型高度保守区域设计特异性引物和探针，在反应体系中含诺如病毒通用型基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。

二、用途：
诺如病毒(Norwalk Viruses，NV)是人类杯状病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中诺如病毒(Norovirus,NV)属的原型代表株。有5个基因群(Gene group G)GI、GII、GIII、GIV、GV。诺如病毒感染性腹泻在全范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。

三、试剂盒组成：(50T/Kit)
组份 数量 规格
RT-PCR反应液(NV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
无核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(NV-PTC) 1管 50μL/管

四、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

五、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列，伯乐系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。

六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
1. 采集时间：粪便样本应在发病日采集，至多不能超过发病急性期(48～72h)，此时为稀、软便，病毒排出量zuì多。
2. 采集方法
(1)一次流行，至少采集10例患者粪便，每份样本量约1～5mL，成形便和肛拭子诊断意义很小；
(2)病人呕吐物是粪便样本的zuì佳补充，有助于病原的诊断。采集、储存和运送条件同于粪便；
(3)从流行病学角度出发，在水、食物或其它外环境样本中检出NV意义重要；
(4)需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上，尽早采样并置4℃存放，若是饮用水，需用大容量(5～100L)浓集病毒后检测；
3.应避免样本间交叉污染。
4.样本收集后可立即检测；若不能立即检测，可置于-20℃以下过夜保存；如需长期保存，样本应冻存于-70℃以下，避免反复冻融。
6.2 RNA提取
可采购北京百奥莱博科技有限公司的RNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(NV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(NV-PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qRT-PCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
反转录(Reverse Transcription) 1循环 45℃ for 10 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在55℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照(NV-PTC)：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明NV核酸阳性。
（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明NV核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行NV qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明NV核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
（1） 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
（2） 所有使用的离心管zuì好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
（3） PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
（4） 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
（5） 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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