WH0029 增强型无内毒素质粒大提试剂盒

增强型无内毒素质粒大提试剂盒是高品质的DNA提取纯化产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科学研究，我公司专注于DNA提取纯化产品的研发、生产和供应，为您提供的增强型无内毒素质粒大提试剂盒质量可靠，批间差小，且价格公道，热切盼望您选购我们的产品。...

特别提示：包括增强型无内毒素质粒大提试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：增强型无内毒素质粒大提试剂盒
英文名称：Enhanced Endotoxin-free Plasmid Mass Extraction Kit
产品货号：WH0029
产品规格：10次

本试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的去内毒素溶液ER和过滤器CS1，可有效的去除内毒素、蛋白等杂质；整个提取过程仅需1h，方便快捷。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和转染多种细胞等实验。推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200 ml，得率一般在50-300 μg左右。

产品特点：
·高纯度：采用独特的内毒素沉淀技术，特异的去除内毒素。
·操作简便：采用吸附柱技术特异吸附质粒，操作更为简便。
·转染：适合包括内毒素敏感细胞在内的大多数细胞的转染。
·应用广泛：动植物细胞转染、分子生物学实验均可应用。

试剂盒组成：

组分	10T
平衡液BL	30ml
溶液P1	125ml
溶液P2	125ml
溶液P4	125ml
去内毒素溶液ER	32ml
缓冲液ED	220ml
漂洗液PW	50ml
洗脱缓冲液TB	30ml
RNase A（10mg/ml)	1.25ml
过滤器CS1	10个
吸附柱CP6	10个
收集管（50ml)	20个

保存条件：室温（15-25℃)干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。次使用前将RNase A加入溶液P1中，混匀后置于2-8℃保存，可稳定保存12个月以上。单独包装的RNase A在室温可稳定保存12个月以上。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)
1．溶液P1在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2．使用前先检查平衡液BL、溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
3．注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
4．使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
5．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液TB推荐在65-70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
6．实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以zuì大限度激活硅基质膜，提高得率。
7．用平衡液处理过的柱子zuì好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。

使用方法：
使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

1．柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50 ml收集管中）加入2.5 ml的平衡液BL，8000rpm （~8228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液处理过的柱子zuì好立即使用）。
2．取100ml （根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200 ml）过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm （~8228×g)离心3 min收集细菌，尽量吸除上清。
  注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中,菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液P1、P2、P4的用量。
3．尽量吸除上清，为确保上清液全部吸取，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。
4．向留有菌体沉淀的离心管中加入10 ml溶液P1（请先检查是否已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
  注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。
5．向离心管中加入10 ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，室温放置5min。
  注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
6．向离心管中加入10 ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm （~8228×g)离心5-10min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器CS1中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50 ml的管中（自备）。
  注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多（>100ml），推荐延长离心时间至20-30 min。
7．加入3 ml红色的去内毒素溶液ER，颠倒混匀后溶液呈现出均匀透明的黄色。可选步骤：如果需要达到更低的内毒素水平，可以将混匀后的上述溶液冰浴20 min后，42℃水浴5 min，5000rpm离心3 min，将上清转移到一个全新的50 ml离心管中。
8．对于高拷贝质粒加入0.3倍上述滤液体积的异丙醇，对于低拷贝质粒加入0.2倍上述滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污染)，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50 ml收集管中)。
  注意：吸附柱CP6的zuì大容积为15 ml，所以需要分2次过柱。个别情况下离心机转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱CP6的溶液体积不超过10 ml，以防产生漏液现象。
9．室温8000rpm （~8228×g)离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。
  注意：将第8步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。
10．向吸附柱CP6中加入10 ml缓冲液ED，8000rpm （~8228×g)离心2 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
11．对于低拷贝质粒，重复操作步骤10一次。
12．向吸附柱CP6中加入10 ml漂洗液PW （请先检查是否已加入无水乙醇)，8000rpm（~8228×g)离心2 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
13．重复操作步骤12一次。
14．将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm （~8228×g)离心5 min，然后将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等)实验。
15．将吸附柱CP6置于一个干净的50 ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2 ml洗脱缓冲液TB，室温放置5 min，然后室温8000rpm （~8228×g)离心5 min。将50 ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5 ml离心管，-20℃保存。
  注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1 ml，体积过小影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

质粒DNA浓度及纯度检测：
得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD₂₆₀值为1相当于大约50 μg/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。

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名称：非酶RNA清除剂1.0
货号：BTN51203
规格：1.5mL
本品为非酶法质粒RNA和蛋白质污染的去除试剂，专用于从碱变性法纯化的质粒中去除其中的大部分RNA污染和大部分蛋白质污染。

产品特点：
1.，能去除质粒粗提物中80%左右的RNA污染和60%的蛋白污染。而常用的RNase或LiCl处理只能去除RNA，不能去除蛋白质污染。
2.快速，整个过程只需要十余分钟，不需要37℃保温。
3. 经过本产品处理过的样品，由于没有RNA和蛋白质的干扰，使用硅胶膜或其他吸附离心法吸附、回收质粒DNA的效率比没处理过的样品更高。
4. 价格不到RNase A的1/2，在质粒的大规模制备时成本更加明显。
5. 制备临床用(如基因治疗)的质粒DNA时，可以减少后期在临床报批、生产、质检和使用中的很多麻烦(使用生物来源的RNase A和蛋白酶时，容易带入对人体有害的内毒素、LPS等污染物)。

储存条件：常温运输和保存，有效期一年。

使用方法：

一、从碱变性澄清液中去除RNA和蛋白质
1. 将约1/5体积的RNA Scavenger加入到碱变性澄清液中(加溶液III后离心得到的上清液一般是450μl，所以需要加入50μl)。
2. 混匀后室温放置10分钟。
3.室温8000g离心10分钟。
4.转移上清到一新的离心管中，后续处理跟经典的方法一样(即加入等体积的异丙醇或两倍体积的乙醇,混匀后室温离心10分钟,弃上清液后用1mL 75%乙醇洗一次,短暂离心，去掉残留液体,加入适量TE缓冲液溶解质粒待用)。

二、从质粒粗提液中去除RNA和蛋白质
1、将1/4体积的RNA Scavenger-1直接加入到已经溶解在TE或其他溶解液的质粒DNA中。
2、混匀后室温放置10分钟。
3、室温8000g离心10分钟。
4、转移上清到一新的离心管中，加入等体积的异丙醇或两倍体积的乙醇。
5、混匀后室温离心10分钟。
6、弃上清液后用1mL 75%乙醇洗一次。
7、短暂离心，去掉残留液体。
8、加入适量TE缓冲液溶解质粒待用。

使用效果：

图注：用经典的碱变性法从1.5mL E.coli过夜培养液中提取的pGEM-3质粒粗提物(加溶液ⅡI离心上清)经过RNA Scavenger处理后(LA+RNA Scavenger)与未经处理的样品(AL)电泳比较。上样量为1/5。

图注：用经典的碱变性法提取的pGEM-3质粒DNA溶于TE中后，经过RNA Scavenger处理的(+)与未经处理的(-)样品进行电泳比较。处理过的样品失去80%左右的RNA。

疑难解答：
Q：电泳检测质粒DNA时也需要将其RNA污染去掉吗?
A：是。否则RNA 将结合大部分的EB溶液,使质粒DNA的带型减弱。
Q：RNA Scavenger-1跟RNA Scavenger-2 有何区别？
A：
1. RNA Scavenger-2处理过的样品不再需要醇/盐沉淀处理，而RNAScavenger-1处理的样品还需要醇/盐沉淀去除RNA Scavenger-1；
2. RNA Scavenger-2与柱式硅胶膜纯化方法兼容，而RNA Scavenger-1 不兼容；
3. RNA Scavenger-2 不但可以用于去除质粒DNA的RNA污染，还可以用于去除基因DNA的RNA污染，而RNA Scavenger-1只能用于质粒DNA样品。

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货号	名称	规格
BTN90901	菌体内毒素清除剂	200mL
BTN101112	柱式水样DNA提取试剂盒	50次
ALH156	酵母基因组DNA大量提取试剂盒	10次
ALH158	细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒(分离基因组DNA)	20次|50次
ALH160	hoeschst凋亡小体染色试剂盒	100次
ALH172	病毒DNA提取试剂盒	50次
ALH174	口腔拭子基因组DNA提取试剂盒	50次

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