MTAXXXXX microRNA荧光定量PCR试

microRNA荧光定量PCR试由专业试剂供应商北京百奥莱博提供，用于科学研究，我公司的microRNA荧光定量PCR试品质上佳，经过多年的开发生产，已然非常成熟，欢迎广大新老客户订购。...

特别提示：包括microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：microRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)
英文名称：microRNA SYBR Green PCR Kit
产品货号：MTAXXXXX
产品规格：20μl×100次

microRNA荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green荧光染料)采用特异性的上下游引物对反转录所得microRNA的cDNA产物进行定量检测。不同于其它公司的单条特异性引物扩增方法，Biorab采用双向特异性扩增引物（原理如图1），从而大提高了miRNA的检测特异性，其可以区分高相似度的miRNA分子、减少非特异性扩增（图2，3所示）。该miRNA荧光定量PCR试剂盒对可以对任何miRNA分子进行检测。miRNA荧光定量PCR试剂盒共有一万余种，试剂盒编号为MTAXXXXX，每一个miRNA分子对应一个检测试剂盒，可下载SYBR Green miRNA qPCR kit列表查询。如果您研究的miRNA分子不在我们的列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计。该试剂盒中的每一对引物均经过设计优化，确保扩增效率和特异性。





产品组成：

组分	MTAXXXXX(100T)
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	1ml
50×ROX Reference Dye	200μl
microRNA Primer F（10μM）	100μl
microRNA Primer R（10μM）	100μl
microRNA 标准品(1pM)	100μl

储存：请置于-20℃，可保存2年；避免反复冻融。

操作方法：

1．按以下组分配制反转录反应液(反转录反应需购买我司的一步法microRNA反转录试剂盒)：

模板	microRNA	0.01-0.1μg
	Total RNA	0.1-2μg
4×One step miRNA RT Solution		5μl
10×miRNA RT Primer		2μl
Rnase-Free H2O		Up to 20μl

2．在PCR 仪上按以下条件进行反应:
  37℃——————60min
  95℃——————5分钟
3．获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。根据机型选择步骤A或B配制反应体系：
步骤A：需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
50×ROX Reference Dye	0.4μl	1×
miRNA Primer F(10μM)	0.4μl
miRNA Primer R(10μM)	0.4μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。
步骤B：无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的RealTime PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

加入物	加入量	终浓度
2×Hi SYBR Green qPCR Mix	10μl	1×
miRNA Primer F(10μM)	0.4μl
miRNA Primer R(10μM)	0.4μl
cDNA 模板	1～2.5μl
ddH2O	Up to 20μl

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。

4．进行 Real-Time PCR 反应，通常采用两步法，程序如下：

程序	温度	时间	循环数
Stage 1：	95℃	15分钟
Stage 2：	95℃	10s
	60℃	30s	35cycles
Stage 3：	Dissociation analysis

注意：使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子，过多的循环数会造成性降低。推荐的循环数为 30 个，在检测低样品浓度时可将循环数调整到 35 个。

5．扩增结果分析和数据处理：
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。


6．标准品的使用
  该试剂盒配备的标准品为单链 DNA 分子，其与目标microRNA 分子反转录产物完全相同，因此可直接用于 PCR扩增，从而检测 PCR 体系的可靠性。其浓度为 1pM，通常20μl PCR 体系中加入1μl，可获得 Ct 值在15 左右的数据。除此外，可以使用TE Buffer 进行稀释，zuì低可稀释到0.01fM，用于标准曲线扩增或定量试验。

常用内参miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法)

货号	内参名称	适用物种
MTA01501	RNU6B	哺乳动物
MTA01502	RNU48	人
MTA01503	RNU44	人
MTA01504	SnoRNA135	鼠
MTA01505	SnoRNA202	鼠

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BTN130841 石蜡油，PCR级 10mL
BTN130957 免RNA提取RT-PCR试剂盒(细胞组织裂解物RT-PCR试剂盒) 100次
WE0100 PCR Mix(含染料)(滴瓶装) 5ml
WE0106 2×BAmp MasterMix(含染料) 5ml
WE0111 BaldStar Taq DNA Polymerase 500U|2500U
WE0115 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶) 200U|1000U

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名称：即用型荧光定量RT-PCR试剂盒
货号：BTN101219
规格：50次
本产品是基于荧光染料检测的即用型双酶一管式RT-PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量RT-PCR分析(quantitative RT-PCR、qRT-PCR)。产品含有经过优化的缓冲液组分、MMLV-Taq DNA聚合酶混合物、dNTPs、MgCl2及荧光染料DNAgreen等所有一管式实时定量RT-PCR所需要的成分，用户只需加入RNA模板和引物即可进行实时定量RT-PCR反应，具有广泛的用途。

产品特点：
1.一管式完成qRT-PCR反应，避免样品交叉污染，尤其适合临床应用。
2. 即开即用，用户不需要单独准备qRT-PCR所需的各种试剂。
3. 主要成分只有两个(RT-PCR buffer和MMLV-Taq Mix)，将加样步骤减少到zuì低，大降低了加样误差，增加了可重复性。
4. 使用范围广，适用于从病毒RNA到人RNA的各种RNA模板。
5.高灵敏度，每个RT-PCR体系zuì低可以检测200拷贝的RNA分子，可扩增的模版RNA的zuì长达2000nt。

试剂盒组成：

成分	规格
双酶一管式qRT-PCR Buffer，2×	750μl
MMLV-Taq Mix	100μl
RNase-free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

使用方法：
1.在一干净的无RNase的PCR管中，先加入下列成分(下面只列出样品管的设置情况，用户可自己根据需要设置阳性和阴性对照)：

成分	样品
自备RNA模板(分下面三种情况)	见下
总RNA	100-500ng
或poly(A)mRNA	10-500ng
或体外转录得到的专一RNA	0.01pg-500ng
RNA特异性引物一(自备)	终浓度300nM(注1)
RNA特异性引物二(自备)	终浓度300nM
RNase-free水	补到10μL
双酶一管式qRT-PCR Buffer(2×)	15μl
自备ROX(某些荧光PCR机型需要)	3μL(注2)
MMLV-Taq Mix	2μl

 注1：通常初次使用本试剂时，可用引物浓度300nM进行实验，根据实验结果具体情况，在200～800nM范围内调整引物浓度。引物、待检样品的具体加量用户可以根据实际情况调整，同时增减RNase-free水用量，保证总反应体积不变即可。
 注2：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900，ROX的zuì佳浓度为1×(即在每30μl反应体系中加3μl 10×ROX)。对ABI 7500，ROX的zuì佳浓度为0.05-0.1×(每30μL反应体系加0.3μL 10×ROX；也可将10×ROX稀释到1×，然后每个反应体系加入3μL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000，RotorGene3000，RotorGene 6000和LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
2. 轻柔混合均匀后放入PCR仪中进行荧光定量RT-PCR。
3. 设定RT-PCR反应条件时，一般将RT的条件设定成42℃ 30分钟，后接94℃变性5分钟，然后进入PCR循环(PCR参数将根据自备引物的Tm值和PCR产物长度由用户自行决定注)、zuì后72℃ 5分钟。并在退火或延长步骤中记录荧光信号。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时，zuì大吸收光谱在471nm，结合DNA时的zuì大吸收光谱在500nm，zuì大发射光谱在530nm。

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