SYA017 肉毒杆菌AB型双重荧光PCR检测

肉毒杆菌AB型双重荧光PCR检测由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品用于科研试验，我公司专注于细菌PCR检测试剂盒产品的研发、生产和供应，为您提供的肉毒杆菌AB型双重荧光PCR检测质量可靠，批间差小，且价格公道，热切盼望您选购我们的产品。...

特别提示：包括肉毒杆菌AB型双重荧光PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：肉毒杆菌AB型双重荧光PCR检测试剂盒
英文名称：Botulinus A/B Fluorescent PCR detection kit
产品货号：SYA017
产品规格：48次/盒

本试剂盒适用于检测粪便、水、血液等样本肉毒杆菌(BL) A/B型DNA，用于肉毒杆菌(BL) A/B型感染的辅助诊断。其检测结果仅供参考。
【原理】
本试剂盒用一对肉毒杆菌(BL)A/B型特异性引物和一条特异性荧光探针，经过裂解提取DNA，后者在Taq DNA聚合酶作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对肉毒杆菌(BL) A/B型DNA进行体外扩增，从而达到快速检测肉毒杆菌(BL) A/B型之目的。
【组成】
名称 数量 规格
核酸提取液 1管 2ml/管
Taq 酶系 1管 50μl/管
BL-A/B-qPCR MIX 1管 1000ml/管
BL-A/B -阳性质控品 1管 50μl/管
阴性质控品 1管 250μl/管
【储存条件】-20℃保存，避免反复冻融。
【试剂规格及有效期】48T/盒，有效期6个月。
【适用仪器】
双通道及以上PCR仪器。
【标本采集和保存与运输】
1. 人或动物：
采集新鲜粪便，取黏液脓血部位标本，密闭送检。
2．血液：
采集新鲜抗凝血(非肝素抗凝)，密闭送检。
【使用方法】
1． DNA提取
1.1 粪便：挑取米粒大小粪便(尽可能取黏液脓血部分)，于放置有0.5ml生理盐水的离心管中，振荡混匀，13000rpm离心2分钟。弃上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，13000rpm离心5min取上清4μl做PCR反应。
1.2 水标本：取水样3ml，13000rpm离心2min；弃上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，13000rpm离心5min取上清4μl做PCR反应。
1.3 血液标本：取2ml抗凝血，静置待自然分层，吸取上层（血浆层）及中层（Buffy coat层），13000rpm离心2分钟。弃上清，沉淀中直接加入100μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min，13000rpm离心5min取上清4μl做PCR反应。
2．PCR扩增
从试剂盒中取出BL-A/B-qPCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂 BL-A/B-qPCR MIX Taq酶系
用量 20μl 1μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入21μl，向每管中加入处理后样品或BL-阳性质控品和阴性质控品4μl，10000rpm瞬时离心10秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，推荐循环条件:94℃→2分钟，后94℃ 30秒→55℃ 45秒，40个循环。
荧光通道选择：检测选择FAM通道和HEX/VIC/JOE通道。如果使用ABI系列仪器，请务必在passive reference和quencher处均选择“NONE”。
3. 结果分析判定
FAM通道：Ct值≤35肉毒杆菌A型为阳性；Ct 值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在37-40个循环之间，判断肉毒杆菌A型为阳性，没有荧光值增长肉毒杆菌A型为阴性。
HEX/VIC/JOE通道：Ct值≤35肉毒杆菌B型为阳性；Ct值在35-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct值仍然在37-40个循环之间，判断肉毒杆菌B型为阳性，没有荧光值增长肉毒杆菌B型为阴性。
【质控标准】
阴性质控品：FAM和HEX/VIC/JOE通道全部阴性。
BL-阳性质控品：FAM和HEX/VIC/JOE通道的Ct值均应小于30.0。
以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效。
【注意事项】
初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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规格：48次/盒
一、简介
本试剂盒用三对炭疽杆菌特异性引物(Cap/robB/pagA)，各结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对炭疽杆菌核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

二、用途
该试剂盒适用于检测皮肤水泡液、咽拭子、可疑食物等样本中的炭疽杆菌特异性核酸序列(pX01质粒-pagA基因；pX02质粒-cap基因；染色体-rpoB基因)进行扩增，用于炭疽杆菌感染的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成(48T)
组份 数量 规格
反应液(qPCR MIX) 1管 480μL/管
pagA荧光引物和探针 1管 240μL/管
Cap荧光引物和探针 1管 240μL/管
rpoB荧光引物和探针 1管 240μL/管
DNA抽提液(DNA Extraction) 2管 1.5mL/管
阴性对照(NTC) 1管 50μL/管
阳性对照(PTC) 1管 50μL/管

四、荧光PCR仪器适用范围
ABI系列、MJ系列、Roche系列，博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。

五、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。

六、样品采集、前处理与DNA提取
6.1 样品采集
皮肤炭疽，取水泡液1mL；肺炭疽，采集咽拭子标本，放入标本采集管中；肠炭疽，取粪便1g。
6.2 样本前处理：
固体样本：手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中，液体样本：直接取上100μL于1.5mL灭菌离心管中。
6.3 DNA提取
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)，并按照相应试剂盒说明进行操作。
对上述处理好的样本加入50uL核酸提取液，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(qPCR MIX)、引物及探针，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 10µL N×10µL
Cap或robB或pagA引物及探针 5µL N×5µL
总量 15µL N×15µL
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
1循环 50℃ for 2 min
预变性 1循环 95℃ for 10 min
PCR扩增 40循环 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
8.2 试验成立判定
(1) 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
(2) 阳性对照(PTC)：均产生扩增曲线。
(3) 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
(1) 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明核酸阳性。
(2) Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明核酸阴性。
(3) 如果Ct值>35，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
(4) 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行qPCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明核酸阳性；否则判为样本阴性。

九、注意事项：
(1) 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
(2) 所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
(3) PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
(4) 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
(5) 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。


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