QN1060 pET-28a(+)载体

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特别提示：包括pET-28a(+)载体在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：pET-28a(+)载体
产品货号：QN1060
产品规格：20ug

pET-28a(+)是一种常用的融合蛋白类型原核表达载体，含有抗卡那霉素基因。表达由宿主细 胞提供的 T7 RNA 聚合酶诱导。

宿主菌：建议克隆用 E.coli DH5α 或 0 做受体菌;表达用 E.coli BL21(DE3)或 BL21(DE3)pLysS 做受体菌。

储存条件 ：-20℃

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名称：大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)感受态细胞
货号：BTN130559
规格：0.1mL*10
 Rosetta-gami(DE3)是常规表达宿主菌，用于含二硫键真核蛋白表达，细胞质二硫化物还原途径有两个突变，可以增加E.coli细胞质中二硫键的形成。提供稀有密码子 tRNAs。抗性为四环素(12.5μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)。

基因型：Δ(ara –leu)7697 Δlac X74 Δpho A Pvu II pho R ara D139 ahp C gal E gal K rps L F"[lac +lac Iq pro ](DE3)gor 522::Tn10(TcR)gor B::kan pRARE(CmR)。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

名称：酿酒酵母Y187感受态细胞
货号：BTN140389
规格：10×100μL
 Y187菌株是Clontech公司开发的GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株(Y2HGold，AH109等)通过mating 操作进行筛库试验。Transformation marker 为: trp1，leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。Y187-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1～ 174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C 端768～881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互的两个结构域：位于N 端1～174 位氨基酸区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C端768～881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD 融合，形成 bait 融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果 bait和prey发生相互作用，就会促使 BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。Y187 有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子(G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4 识别的17bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。

 Y187感受态细胞是实验室常用酵母双杂用菌株，本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为104 cfu/μg DNA。

菌株基因型：MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4Δ，met–,gal80Δ，URA3: :GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ，MEL1

产品组成：

成分	规格
Y187感受态细胞	0.1ml×10支
PGADT7(control vector)，10 ng/μL	10μl
Carrier DNA，5μg/μL	100μl
PEG/LiAc	5ml
说明书	1份

储存条件：感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/liAC、PGADT7质粒4℃保存；有效期半年。

自备试剂：目的DNA、YPDA、SD培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入预冷的目的质粒2-5μg，CarrierDNA(95-100℃ 5分钟，快速冰浴，重复一次)10μL，PEG/LiAc 500μL，吹打混匀，30℃水浴30分钟(15分钟时翻转6-8次混匀)。
3. 42℃水浴15分钟(7.5分钟时翻转6-8次混匀)。
4. 5000rpm离心 40秒，弃上清。取400μL ddH2O 重悬沉淀，5000rpm离心 30秒，弃上清。
5. 取 50μL ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96小时。

注意事项：
1. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h培养可见直径1mm 克隆。
2.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3.转化高浓度的质粒可相应减少zuì终用于涂板的菌量。
4. 同时转化 2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

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