JN0006 一步法RT-PCR试剂盒
- 产品/服务：JN0006 一步法RT-PCR试剂盒
- 型 号：JN0006
- 品 牌：百奥莱博
- 单 价：面议
- 更新日期：2023-05-23
- 有效期至：长期有效
- 浏览次数：1078
产品简介
我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括一步法RT-PCR试剂盒在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...
产品详细介绍
特别提示：包括一步法RT-PCR试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：一步法RT-PCR试剂盒
英文名称：Balbs
产品货号：JN0006
产品规格：200次
本试剂盒是基于本公司Balbs
产品特点：
1、效率高，可反转录GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
2、独特的缓冲体系使反转录酶和聚合酶同时发挥zuì大功效。
3、操作简单，可zuì大限度的避免污染。
试剂盒组成：
| 组份 | JN0006-200次 |
|
Balbs | 200μl |
|
2×Balbs | 1ml×2 |
| RNase Free Water | 1ml×2 |
注意事项：
1、本试剂盒PCR扩增延伸时间为1kb/min，客户可根据具体片段长度进行延伸时间的调整。
2、通常情况，28～30个循环可达到zuì佳扩增，对于低拷贝目的基因的检测，可将循环数增加到40个。
3、如果同时操作多个样品，建议先在冰上先配制预混液，然后再分装到各个反应管中，加入模板启动反应。
4、反应出现目标条带拖带，系模板浓度过高或特异引物浓度不适等原因所致，可对模板及引物浓度等进行调整；反应出现杂带，可对退火温度进行调整，或重新设计特异性高的引物。
5、本试剂盒只需使用特异性反转录引物，无需使用Random Primer和OligodT Primer等进行反转录反应。
6、为了保证反应的正常进行，需使用高质量的RNA模板。
操作方法：
1、将RNA模板、引物、2×Balbs
2、配制以下反应体系：
| 组分 | 体积 |
| 模板RNA | 0.1ng-5ug |
|
Balbs | 1μl |
|
2×Balbs | 10μl |
| 上游引物,10μM | 0.5-1μl |
| 下游引物,10μM | 0.5-1μl |
| ddH2O | 至20μl |
3、轻轻混匀后短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
4、设置反应程序：
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 42℃ | 5min/500bp | |
| 95℃ | 5min | |
| 95℃ | 20秒 | 25-30次循环 |
| 57℃ | 20秒 | |
| 72℃ | 根据产物长度调整，60秒/kb | |
| 72℃ | 5分钟 | |
| 4℃ | 保温 |
应用实例：
图例一）小鼠胚肝总RNA使用百奥莱博一步法RT-PCR扩增。
泳道1-9总RNA量分别为1ng-0.01pg，10倍梯度稀释，目的基因：GAPDH，扩增灵敏度可达到0.1pg。
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储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。
名称：可调式易错PCR试剂盒
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规格：100次
易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错PCR和常规PCR的比较如下：
产品特点：
1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3.可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4.可以扩增的DNA片段更长，达到3kb，对于3kb以上的产物，建议分段扩增。
试剂盒组成：
| 成分 | 规格 |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 100μl |
| 易错PCR专用dNTP 2.0,10× | 300μl |
| 易错PCR Mix 2.0,10× | 300μl |
| 易错PCR专用MnCl2 | 300μl |
| 易错PCR专用dGTP | 300μl |
| 超纯水 | 1ml |
储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期为一年。
使用方法：
1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。
注意：引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2，B表示易错PCR专用的dGTP：
| 预期突变数 | 2个 | 3个 | 4个 | 5个 | 6个 | 7个 | 8个 |
| A的用量(μl) | 0 | 1.0 | 2.5 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| B的用量(μl) | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
3.以30μL的标准PCR反应体系为例，如果反应体系不是30μL，各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中，加入下列成分
注意：可以先计算出超纯水的用量，优先加水
| 成分 | 用量 |
| 超纯水 | 根据第2步加 |
| 易错PCR Mix,10× | 3μl |
| 易错PCR 专用dNTP，10× | 3μl |
| 易错PCR 专用MnCl2 | 根据上步 |
| 易错PCR 专用dGTP | 根据上步 |
| 自备DNA模板(1ng/μl) | 1μl |
| 自备PCR引物(10μM each) | 1μl each |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 1μl |
4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表)，然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件，一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言)：
| PCR前变性 | 94℃ 3分钟 |
| 易错PCR(循环30次) | 94℃ 1分钟 |
| 45℃ 1分钟 | |
| 72℃ 1分钟 |
注：易错PCR一般不需要热启动，也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增
加1Kb，时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率，进而决定每个PCR产物可能的突变位点数，所以所需循环数由客户根据需要改动。
5.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板，进行下一轮的易错PCR。
疑难解答：
Q：现象：没有PCR产物。
A：可能原因：一是引物没有优化，可以重新设计引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不纯，zuì好先胶回收；四是溶解DNA的溶液中有EDTA，降低了PCR反应体系的Mg离子浓度，可以适当补加Mg离子。
Q：现象：太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A：可能原因：一是PCR循环数太多；二是复性温度太低；三是延伸时间太长；四是引物没有优化，可以重新设计引物；五是PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR；六是模板有其他DNA污染；七是DNA模板质量不高或者浓度太高。
Q：如果需要更高的突变率，如何办？
A：可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板，否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板，但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
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